

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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
1.研究MiCroRNA-23a在胰腺癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理資料的關(guān)系。
2.研究MiCroRNA-23a在不同胰腺癌細(xì)胞株(Aspc-1,Bxpc-3,Cfpac-1,Panc-1)的表達(dá)規(guī)律。
3.研究MiCroRNA-23a體內(nèi)體外促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
4.研究MiCroRNA-23a通過(guò)靶向抑制上皮剪接調(diào)節(jié)蛋白1(epithelial splicingregulato
2、r protein1,ESRP1)改變CD44亞型表達(dá),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
方法:
1.收集西南醫(yī)院肝膽外科2013年1月~2013年12月手術(shù)切除的胰腺癌標(biāo)本及患者臨床病理資料共計(jì)47例,記錄患者FOS及OS。采用RT-PCR方法檢測(cè)MiCroRNA-23a在胰腺癌原發(fā)灶,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織以及癌旁正常胰
3、腺組織中的表達(dá)情況,比較MiCroRNA-23a在上述三種組織中的表達(dá)差異。計(jì)算癌組織中MiCroRNA-23a的相對(duì)平均表達(dá)量,并根據(jù)該值將所有標(biāo)本分為MiCroRNA-23a高表達(dá)組和低表達(dá)組,分析MiCroRNA-23a表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系。采用Kaplan-Meier軟件進(jìn)行生存分析,研究不同表達(dá)水平的MiCroRNA-23a對(duì)胰腺癌患者預(yù)后的影響。
2.qRT-PCR和Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-
4、鈣黏蛋白(E-cad),N-鈣黏蛋白(N-cad),波形蛋白(VIM)的表達(dá),觀察細(xì)胞形態(tài),TGF-β1誘導(dǎo)EMT處理,區(qū)分胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)spc-1,Bxpc-3,Cfpac-1,Panc-1的上皮、間質(zhì)表型。qRT-PCR檢測(cè)正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(PDC)和胰腺癌細(xì)胞(Aspc-1,Aspc-1+ TGF-β1,Bxpc-3,Bxpc-3+TGF-β1,Cfpac-1,Panc-1)miRNA-23a的表達(dá),觀察其表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞EM
5、T表型的關(guān)系。干擾miR-23a,觀察對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)EMT的影響。
3.miR-23a mimic和miR-23a inhibitor分別轉(zhuǎn)染Aspc-1和Panc-1,觀察其侵襲遷移能力的變化;構(gòu)建miR-23a sponges慢病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞,建立穩(wěn)定細(xì)胞株,裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察miR-23a促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移。
4.基因芯片分析和生物信息學(xué)網(wǎng)站(TargetScan.com)搜索結(jié)果交叉比較,雙
6、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ESRP1是miR-23a的直接靶基因。
5.研究干擾miR-23a對(duì)ESRP1表達(dá)的影響,qRT-PCR檢測(cè)胰腺癌組織ESRP1的表達(dá),與miR-23a的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析;干擾或過(guò)表達(dá)ESRP1,觀察對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響;ESRP1回復(fù)實(shí)驗(yàn),觀察對(duì)miR-23a影響胰腺癌細(xì)胞EMT的逆轉(zhuǎn)作用。
6.Western blot、qRT-PCR分別檢測(cè)miR-23a對(duì)ESRP1及其下游
7、CD44s/CD44v、FGFR2Ⅲb/Ⅲc剪接亞型表達(dá)的影響。ESRP1回復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察干擾miR-23a表達(dá)對(duì)下游剪接分子表達(dá)的影響。
結(jié)果:
1.胰腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中miR-23a的表達(dá)顯著高于胰腺癌原發(fā)灶和癌旁正常組織,胰腺癌MiCroRNA-23a表達(dá)與腫瘤組織分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度(T分期)以及胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N分期)具有顯著相關(guān)性,而其表達(dá)與年齡、性別,腫瘤發(fā)生部位及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M分期)等無(wú)相關(guān)性。生存分
8、析發(fā)現(xiàn),MiCroRNA-23a表達(dá)與胰腺癌腫瘤患者預(yù)后具有相關(guān)性,高表達(dá)組預(yù)后差,生存期均低于低表達(dá)組,兩者相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 Aspc-1、Bxpc-3細(xì)胞呈上皮表型,Cfpac-1、Panc-1為間質(zhì)表型,TGF-β1誘導(dǎo)Aspc-1、Bxpc-3后,發(fā)生EMT。miR-23a在間質(zhì)表型的胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高。結(jié)合miR-23a在胰腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中表達(dá)增高,推測(cè)miR-23a可能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞上皮
9、間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移。干擾miR-23a,抑制了TGF-β1誘導(dǎo)上皮表型胰腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。
3.體外實(shí)驗(yàn)證明,miR-23amimic轉(zhuǎn)染Aspc-1導(dǎo)致其侵襲遷移能力增強(qiáng),miR-23ainhibitor轉(zhuǎn)染Panc-1導(dǎo)致其侵襲遷移能力減弱;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,miR-23a sponges慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞,可以抑制miR-23a的功能,從而抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。
4.基因芯片分析及生物信息學(xué)
10、檢索,證實(shí)ESRP1是miR-23a的直接的下游靶基因,熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)證實(shí)ESRP1是miR-23a的直接靶基因。
5.ESRP1維持胰腺癌細(xì)胞的上皮表型,干擾miR-23a,ESRP1的表達(dá)發(fā)生變化;胰腺癌組織中,ESRP1的表達(dá)與miR-23a的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。ESRP1 siRNA轉(zhuǎn)染Aspc-1后導(dǎo)致其侵襲遷移能力增強(qiáng);ESRP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1后導(dǎo)致其侵襲遷移能力減弱。ESRP1回復(fù)實(shí)驗(yàn),可以部分逆
11、轉(zhuǎn)干擾miR-23a表達(dá)后對(duì)胰腺癌細(xì)胞EMT的影響。
6.qRT-PCR、WB檢測(cè)證實(shí)miR-23a靶向抑制ESRP1的表達(dá),從而導(dǎo)致下游剪接分子CD44s/CD44v、FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表達(dá)變化,ESRP1回復(fù)實(shí)驗(yàn)可以部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-23a表達(dá)對(duì)下游剪接分子表達(dá)的影響。
結(jié)論:
1.MiCroRNA-23a在胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)明顯高于胰腺癌原發(fā)灶及癌旁正常胰腺組織,MiCroRNA-23a
12、表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度以及胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān),MiCroRNA-23a表達(dá)與胰腺癌預(yù)后具有顯著相關(guān)性。
2.上皮表型胰腺癌細(xì)胞低表達(dá)MiCroRNA-23a,間皮表型胰腺癌細(xì)胞高表達(dá)MiCroRNA-23a,當(dāng)上皮表型的胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí),MiCroRNA-23a的表達(dá)顯著增高,因此MiCroRNA-23a可能促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞EMT。
3.過(guò)表達(dá)MiCroRNA-23a能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞由上皮
13、表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化;抑制MiCroRNA-23a表達(dá)能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞由間質(zhì)表型向上皮表型轉(zhuǎn)化。
4.MiCroRNA-23a能夠增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞以及裸鼠體內(nèi)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
5.MiCroRNA-23a通過(guò)靶向抑制ESRP1的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮調(diào)控作用,從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
6.ESRP1通過(guò)調(diào)控CD44s/CD44v選擇性剪接以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc分子的表達(dá)變化影響胰腺
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