miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、研究背景:乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性、高度異質(zhì)性腫瘤之一。根據(jù)2011年 St.Gallen國(guó)際會(huì)議共識(shí)，乳腺癌被分為腔管A型、腔管B型、HER2過(guò)表達(dá)型和基底樣型乳腺癌(BLBC)。BLBC因ER陰性、PgR陰性、HER2陰性，屬于三陰性乳腺癌（TNBC）范疇，在臨床不能應(yīng)用內(nèi)分泌治療，且抗HER2治療無(wú)效，主要治療手段是化療，因此尋找有效針對(duì)三陰性乳腺癌的治療靶點(diǎn)，對(duì)乳腺癌進(jìn)行個(gè)體化治療是目前臨床研究乳腺癌的重要方向。
　　上皮

2、-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是使具有極性的上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)多個(gè)生物化學(xué)改變，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過(guò)程。從啟動(dòng)至完成EMT涉及多個(gè)分子生物過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞骨架蛋白的重組和表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生以及特定miRNA的表達(dá)等。上述分子生物學(xué)的改變將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間的特征發(fā)生一系列變化，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去極性，與上皮細(xì)胞相互作用的基底膜降解，間質(zhì)樣細(xì)胞形成并從其起源的上皮層遷移。正常情況下，EMT是機(jī)體胚胎發(fā)育以及機(jī)體修復(fù)受傷組織

3、的重要調(diào)控機(jī)制，病理情況下，EMT則是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。
　　Snail-2（Slug）是EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)EMT。E-cadherin是一種細(xì)胞粘附分子，可阻止細(xì)胞移動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制 EMT的發(fā)生，E-cadherin丟失是EMT發(fā)生的最主要特征。已經(jīng)證實(shí)，Slug可通過(guò)結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子的E盒而直接抑制其表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致EMT的發(fā)生。

4、>　　miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約22-25nt的非編碼 RNA，可與 mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）結(jié)合，負(fù)向調(diào)控 mRNA。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，均可抑制EMT，降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，屬于腫瘤抑制性miRNA。miR-200c可通過(guò)靶向結(jié)合ZEB1、ZEB2、HMGB1和Pin1等因子調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程，表明miR-200c在調(diào)節(jié)乳腺癌浸潤(rùn)、侵襲

5、、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是目前研究乳腺癌EMT的熱點(diǎn)。
　　Liu、Fu等分別在人前列腺癌細(xì)胞系和惡性膠母質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-200c可通過(guò)靶向下調(diào) Slug進(jìn)而抑制 EMT過(guò)程。本課題組前期通過(guò)基因分析預(yù)測(cè)miR-200c可以與Slug結(jié)合，并以三陰性BT549細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)RT-PCR和Western Blot等技術(shù)檢測(cè)Slug和E-cadherin在mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，采用侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BT549轉(zhuǎn)

6、染miR-200c后侵襲、遷移能力的變化情況，表明miR-200c在BT549中可通過(guò)抑制Slug的表達(dá)進(jìn)而提升E-cadherin的表達(dá)，抑制細(xì)胞遷移。而2015年St Gallen早期乳腺癌國(guó)際專(zhuān)家共識(shí)指出，三陰性乳腺癌之間仍存在較大異質(zhì)性，部分三陰性乳腺癌對(duì)化療敏感，預(yù)后較好；另一部分則對(duì)同樣的化療方案高度耐藥。至本研究開(kāi)題時(shí)，僅有本課題組前期對(duì)三陰性細(xì)胞系BT549轉(zhuǎn)染miR-200c用于研究Slug調(diào)控EMT機(jī)制的報(bào)道，由于乳

7、腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，在其它乳腺癌細(xì)胞系中miR-200c是否通過(guò)上述途徑調(diào)控EMT尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的:本研究選用三陰性細(xì)胞系（BT549、MDA-MB-231）和非三陰性細(xì)胞系（腔管 A型的MCF-7、HER2過(guò)表達(dá)型的SK-BR-3），對(duì)兩組細(xì)胞系轉(zhuǎn)染 miR-200c模擬物及其陰性對(duì)照物，檢測(cè)Slug和E-cadherin在mRNA、蛋白水平的表達(dá)變化情況，觀察 miR-200c對(duì)三陰性細(xì)胞系遷移能力的影響情況，探討

8、 miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)作用，以期為臨床診治三陰性乳腺癌提供新的靶標(biāo)。
　　材料和方法:
　　1.研究對(duì)象和分組:選擇三陰性乳腺癌細(xì)胞系BT549和MDA-MB-231，腔管A型乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，HER2過(guò)表達(dá)型SK-BR-3為研究對(duì)象。所有細(xì)胞均用RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各細(xì)胞系按轉(zhuǎn)染物質(zhì)不同分為：miR-200c模擬物/Lipo2000組（A組）、miR-

9、200c陰性對(duì)照物/Lipo2000組（B組）、miRNA陰性對(duì)照物/Lipo2000組（C組），終濃度均為50 nM，同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)染等量Lipo2000的組別為試劑對(duì)照組（D組），未處理組為空白對(duì)照組（E組）。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染四個(gè)細(xì)胞系均用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2濕潤(rùn)環(huán)境。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)，將細(xì)胞按一定數(shù)量接種于六孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，對(duì)每個(gè)細(xì)胞系按分組不

10、同，在六孔板中分別轉(zhuǎn)染不同物質(zhì)后進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪孔底95%以上時(shí)，進(jìn)行后續(xù)操作。
　　2.2總RNA提取以及RT-PCR提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)并合成 GAPDH、Slug和E-cadherin基因的上、下游引物，檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200c模擬物及其陰性對(duì)照物后Slug和E-cadherin在mRNA水平的表達(dá)情況。2.3總蛋白提取以及 Western Blot提取各組細(xì)胞的總蛋白，用以檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)

11、染miR-200c模擬物及其陰性對(duì)照后Slug和E-cadherin在蛋白水平的表達(dá)情況。2.4劃痕實(shí)驗(yàn)將BT549和MDA-MB-231均勻接種于六孔板中，培養(yǎng)約24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，更換不含抗體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約36-48 h后，用高壓滅菌的200μl槍頭對(duì)各組細(xì)胞劃平行直線，用以檢測(cè)miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞系遷移能力的影響。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于計(jì)量資料，用x±s

12、表示，各株細(xì)胞系間比較和細(xì)胞系內(nèi)各處理組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞選擇:選擇每個(gè)細(xì)胞系對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行消化，并接種于六孔板。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)BT549和MDA-MB-231，選用1×105/孔的濃度將細(xì)胞接種于六孔板以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；對(duì)MCF-7和SK-BR-3，則選用3×105/孔的濃度
　　2.空白對(duì)照組Slug、E-cadherin的mRN

13、A和蛋白表達(dá)量:三陰性細(xì)胞系與非三陰性細(xì)胞系相比，空白對(duì)照組Slug、E-cadherin在mRNA與蛋白水平的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.miR-200c對(duì)兩組細(xì)胞系Slug、E-cadherin的影響:轉(zhuǎn)染miR-200c后，三陰性細(xì)胞系Slug在mRNA和蛋白水平表達(dá)量均明顯降低，E-cadherin在mRNA和蛋白水平表達(dá)量均明顯增高。
　　4.miR-200c對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響:轉(zhuǎn)染 miR-