氟絡草酮睪丸毒性及其機制研究.pdf

1、氟絡草酮(FLC)是一種吡咯烷酮類除草劑，化學名稱為(3RS，4RS;3RS，4RS)-3-氯-4-氯甲基-1-（α，α，α-三氟間甲基）-2-吡咯烷酮。FLC在歐盟和北美國家中廣泛應用，國內也已經引入該藥，已在中國農藥信息網（ICAMA）獲得臨時登記。文獻公布的FLC毒性研究資料非常少，僅JOURNAL OFANDROLOGY在1986年發(fā)表的兩篇會議文摘，指出FLC可引起雄性大鼠出現睪丸萎縮，精子數量和質量下降，血清卵泡刺激素(FS

2、H)升高，生殖功能下降。2010年底，歐洲食品安全局(European FoodSafety Authority(EFSA))公布的FLC毒性評價報告指出，FLC具有可能的雄性生殖毒性，其毒作用靶器官是睪丸與附睪，主要表現為精子數量下降、異常增多，Sertoli細胞（支持細胞）空泡化。2011年3月，歐盟委員會健康與消費者保護總司在發(fā)布的報告中指出FLC是可能的環(huán)境內分泌干擾物。本課題的研究目的包括評價FLC對SD大鼠睪丸的影響、FLC

3、誘導生精細胞凋亡及其可能機制探索和FLC對Sertoli細胞的損傷作用。通過建立SD雄性大鼠FLC暴露模型和Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)、原代培養(yǎng)Sertoli細胞模型，評價FLC的睪丸毒性，探究其發(fā)生的主要通路機制，為FLC健康危險度評價提供基礎資料，并為認識類似結構除草劑的生殖毒性提供借鑒。
　　一、FLC對SD大鼠睪丸的影響
　　40只SD雄性大鼠隨機分為溶劑對照組和FLC低(30mg/kg bw/d)、中(150m

4、g/kg bw/d)、高(750 mg/kg bw/d)劑量組，每組10只。SD大鼠經灌胃染毒，給藥容劑為1mL/100g bw，每日一次，連續(xù)灌胃給藥28天。染毒結束后，運用睪丸組織病理檢查、曲細精管超微結構電鏡觀察、附睪尾精子計數和血清睪酮(T)水平等指標，評價FLC的睪丸毒性。應用試劑盒檢測睪丸組織中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、過氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還

5、原酶(GSH-GR)和谷胱甘肽S轉移酶(GSH-ST)水平。
　　1.FLC影響睪丸組織氧化應激平衡。其中，中、高劑量組脂質過氧化標志物MDA含量明顯增加，各劑量組GSH含量均明顯下降，與對照比較，差異有統(tǒng)計學意義?？寡趸窼OD、CAT、GSH-Px、GSH-GR和GSH-ST，均在FLC的影響下出現了不同程度的活力下降，其中高劑量組與對照組相比，以上抗氧化酶活力均出現有統(tǒng)計學意義的下降;中劑量組除GSH-GR外，其它的抗氧化酶

6、均出現有統(tǒng)計學意義的活力下降;低劑量組只有CAT和SOD活力顯著降低。
　　2.FLC對SD大鼠睪丸毒性主要表現為，高劑量組大鼠睪丸質量、睪丸臟器系數、附睪質量、血清T水平和附睪尾精子計數與對照相比顯著下降。睪丸組織病理檢查:中、高劑量組大鼠睪丸出現不同程度的損傷，包括:1）間質水腫;2）曲細精管結構改變，萎縮;3）曲細精管生精上皮退化變性，生精細胞脫落至曲細精管管腔面;4）精母細胞、精子細胞死亡，管腔內出現多核巨細胞;5）部分曲

7、細精管內的生精細胞耗竭;6）支持細胞空泡化;7)生精細胞細胞核損傷。曲細精管電鏡觀察顯示生精細胞碎裂，精子細胞核仁、線粒體結構異常。睪丸質量，睪丸臟器系數、附睪質量、附睪尾精子計數、血清睪酮和睪丸組織病理學檢查的基準劑量95％置信區(qū)間下限值(95％ BMDL)分別為:65.7、76.0、23、2.4、99.9和12.9mg/kg bw/d。因此，本研究中附睪尾精子計數和睪丸組織病理損傷是對FLC暴露較為敏感的指標。
　　二、FLC

8、誘導原代培養(yǎng)Sertoli-生精細胞凋亡及其可能信號通路機制
　　選擇出生后28-30天的雄性SD大鼠，采用兩步酶消化法制備Sertoli-生精細胞原代共培養(yǎng)體系。設立0.1％二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照組和3個FLC劑量組(10-8、1o-7和10-6 M)。實驗結果顯示:
　　1.按以上劑量染毒6和24h后，開展四甲基偶氮唑鹽(MTT)試驗和生精細胞脫落計數，結果顯示，相對溶劑對照組，染毒6h后，高劑量組細胞活力降至8

9、4.76±4.91(％)，染毒24 h后，各劑量組細胞活力分別降至72.16±2.53、50.62±4.13和44.30±12.66(％)。FLC染毒6、12、24和48 h后，各劑量組生精細胞脫落相對溶劑對照組，均顯著增加，且呈劑量-反應關系和時間-劑量關系。
　　2.FLC染毒24 h后，收集劑量組與溶劑對照組脫落的生精細胞和培養(yǎng)的貼壁細胞（包括貼壁培養(yǎng)的Sertoli細胞和黏附于其上的生精細胞），用annexinⅤ結合試驗檢

10、測各組細胞凋亡情況。與各自的溶劑對照組相比，各劑量組脫落的生精細胞中，早期凋亡細胞百分比明顯增高至24.25±2.88，33.08±2.43和29.23±2.54(％)，晚期凋亡/壞死細胞百分比明顯增高至17.35±1.16，23.14±1.06和20.70±0.48(％)，差異有統(tǒng)計學意義。各劑量組共培養(yǎng)的Sertoli-生精細胞與對照組相比，早期凋亡細胞百分比顯著增加至10.80±1.86，13.52±0.72和16.62±0.35

11、(％)，差異有統(tǒng)計學意義，但晚期凋亡/壞死細胞百分比沒有顯著性改變。
　　3.FLC染毒24、48和72h后，對Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)體系中Fas/FasL、線粒體凋亡信號通路，以及核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NFκB)、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路相關基因表達的影響。FLC染毒24 h使中劑量組半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)8基因表達水平明顯升高;染毒24、48與72h后，高、中、低劑量組

12、均使B淋巴細胞瘤基因-2(Bcl-2)表達水平不同程度顯著下降，呈劑量-反應關系和時間-反應關系;FLC也上調了Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Bel-2相關死亡啟動子(Bad)、細胞色素c(Cytochrome c)、caspase9和caspase3基因的表達水平。FLC染毒72 h后，中、高劑量組NFκ B家族成員P50、 P65基因表達顯著上調。而高劑量FLC染毒24 h即可使高劑量組p38 MAPK基因表達明顯增加，染毒48和

13、72h，各劑量組p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)基因表達都顯著增加，FLC對p38 MAPK基因表達的影響呈劑量-反應和時間-反應關系。
　　三、FLC對大鼠原代培養(yǎng)Sertoli細胞的毒作用
　　選擇出生后18-21天的雄性SD大鼠，采用兩步酶消化制備Sertoli-生精細胞，細胞接種24h后，用20 mmol/L Tris-HCl(pH=7.4)低滲處理，純化Sertoli細胞，建立Sertoli細胞原代培養(yǎng)體

14、系。通過原代Sertoli細胞生長曲線，確定純化后第2天開始對數生長期。設立0.1％ DMSO溶劑對照組和3個FLC劑量組(10-8、10-7和10-6M)。
　　1.按以上劑量染毒6、12和24h后，開展MTT試驗。染毒12h中、高劑量組原代培養(yǎng)Sertoli細胞增殖活力明顯下降。染毒24 h各劑量組細胞增殖活力分別降至74.7±2.5、56.1±4.4和52.3±6.4(％)，呈劑量-反應關系。
　　2.免疫熒光染色試驗

15、顯示，FLC染毒6、12、24、48與72h，緊密連接(TJ)的重要組成蛋白封閉蛋白(Occludin)與閉鎖小環(huán)蛋白-1(ZO-1)水平發(fā)生變化。染毒6h，中、高劑量組Occludin蛋白水平明顯變化。染毒24和48h，各劑量組誘導Occludin水平更明顯下降。高劑量染毒24h使Occludin基因表達顯著下調。FLC處理原代培養(yǎng)Sertoli細胞12h，中、高劑量組ZO-1蛋白表達顯著下調。染毒24和48h，各劑量組誘導ZO-1表

16、達下降更為明顯，呈劑量依賴性。染毒24、48與72h中、高劑量組ZO-1基因表達顯著下調，ZO-1基因水平隨著FLC濃度的增加而降低，呈劑量-反應關系。
　　3.按以上劑量染毒6、12、24、48與72h，FLC對原代培養(yǎng)Sertoli細胞分泌功能相關基因表達有不同程度的影響。染毒24、48和72h，各劑量雄激素結合蛋白(ABP)基因表達隨劑量增加而下調;染毒6、12和72h，高劑量組轉鐵蛋白Tf基因表達顯著下調。FLC染毒24和

17、48h抑制素B(INHB)基因表達隨FLC濃度的增加而降低，呈現劑量-反應關系且各劑量組INHB基因表達與其相應的溶劑對照組相比有顯著下調。染毒72h，只有高劑量組INHB基因表達明顯下調。
　　總結上述實驗結果，FLC染毒28天可使SD雄性大鼠睪丸組織氧化應激水平升高、降低血清睪酮水平、睪丸曲細精管生精上皮退行性改變、Sertoli細胞空泡化，含吞噬小體的多核巨細胞增多，附睪尾精子計數下降。FLC可通過抑制Bcl-2和上調Bax

18、和Bad基因表達，使Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)體系內生精細胞發(fā)生凋亡。內源性凋亡信號通路可能是其主要的凋亡機制之一。同時NFκB和p38 MAPK信號通路也可能通過抑制抗凋亡基因Bcl-2和/或上調促凋亡蛋白基因Bax和Bad表達，參與調節(jié)FLC引起的Sertoli-生精細胞共培養(yǎng)體系中細胞凋亡。在原代培養(yǎng)Sertoli細胞中，FLC降低了TJs結構蛋白Occludin與ZO-1水平，影響B(tài)TB結構完整性;同時Sertoli細胞旁分

19、泌的重要蛋白——ABP、Tf和INHB相關基因表達也在FLC影響下下調。說明FLC對Sertoli細胞存在毒作用。
　　由此提出FLC睪丸毒性的可能機制是:
　　1)誘導睪丸組織產生氧化應激，損傷睪丸組織結構的完整性，破壞生精過程需要的特定微環(huán)境;
　　2)直接作用于生精細胞，通過內源性信號通路主導，NFκ B信號通路和p38MAPK信號通路協(xié)助，誘導生精細胞凋亡，破壞正常的生精過程;
　　3)影響Sertoli