有機(jī)磷農(nóng)藥-敵敵畏的發(fā)育生殖毒性及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立并確證有機(jī)磷農(nóng)藥的代表-敵敵畏誘導(dǎo)先天性尿道下裂的大鼠模型，探討雄性哺乳動(dòng)物先天性尿道下裂的病因，并研究廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥具有的發(fā)育生殖毒性進(jìn)行研究。 方法： (1)敵敵畏(DDVP)誘導(dǎo)雄性大鼠先天性尿道下裂模型的建立和確定：初孕清潔級(jí)大鼠40只隨機(jī)分成4組：生理鹽水對(duì)照組10只，敵敵畏高、中、低劑量組各10只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，設(shè)敵敵畏5 mg／kg／d、1.25 mg／kg／d和0.625 mg／kg/d

2、三個(gè)劑量組。各組孕大鼠均在孕11天～18天，每晨管喂相應(yīng)藥物1.5ml～2ml一次，共連續(xù)管喂8次；停藥后待其孕20天(d20)的下午，從一側(cè)股血管放血處死孕鼠，剖開子宮，剔除胎盤、臍帶，在肉眼、解剖顯微鏡觀察雄性胎鼠觀察胎鼠外觀及外生殖器形態(tài)畸形變化，同時(shí)測(cè)量體長(zhǎng)、肛生殖距離(AGD)，檢查吸收胎、活胎及晚死胎等，建成尿道下裂動(dòng)物模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)組畸形、未發(fā)現(xiàn)畸形的雄性胎鼠和對(duì)照組的生殖腺逐一確定性別并取材，對(duì)其生殖結(jié)節(jié)固定，再進(jìn)行5μm

3、連續(xù)組織橫斷切面，每200μm取出2張切片，HE染色后顯微鏡放大100～400倍拍照，確證雄性胎鼠尿道下裂畸形存在。 (2)先天性尿道下裂的病因?qū)W探討：取得三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有孕鼠的全血，靜置后離心，得到約1．5ml血清，用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清雄激素雙氫睪酮(DHT)，檢測(cè)敵敵畏染毒對(duì)孕鼠性激素水平的影響。 (3)有機(jī)磷農(nóng)藥的發(fā)育生殖毒性的研究：有機(jī)磷農(nóng)藥-敵敵畏的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組的雄性胎鼠的生殖腺及尿生殖

4、結(jié)節(jié)固定包埋，明確陰莖方向后，垂直陰莖縱軸連續(xù)切片中，每200μm取出6張連片及各實(shí)驗(yàn)組臨產(chǎn)雄性胎鼠性腺-睪丸包埋固定后分別切片，均行相應(yīng)的免疫組化方法檢測(cè)，探索激素ER，AR，LH，激素代謝酶AROM，增殖PCNA，凋亡因子CASEPASE-3在尿道周圍組織及睪丸組織細(xì)胞中表達(dá)有無差異，以了解有機(jī)磷農(nóng)藥的作用機(jī)制。 結(jié)果： (1)生理鹽水灌胃對(duì)照組未有雄性尿道下裂畸形胎鼠發(fā)生，敵敵畏5mg/kg/d、1．25 mg/k

5、g/d和0.625 mg/kg/d三個(gè)劑量組均誘導(dǎo)出仔代尿道下裂畸形，發(fā)生率分別為57.1％、33％和20.8％；敵敵畏各劑量組都有縮短臨產(chǎn)雄性胎鼠肛生殖距(AGD)的作用(P<0.05)；敵敵畏各劑量組可以明顯降低雄性胎鼠的體重(P<0.01)。對(duì)每組胎鼠均行解剖并確認(rèn)性別，避免誤判。實(shí)驗(yàn)組雄性尿道下裂胎鼠及對(duì)照組雄性胎鼠的陰莖進(jìn)行連續(xù)組織切片，每200μm取出1張切片，HE染色照相，同距離切片對(duì)比能清楚看出尿道下裂胎鼠的陰莖腹側(cè)尿道

6、溝敞開，包皮缺損較對(duì)照組明顯長(zhǎng)而寬。 (2)電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定臨產(chǎn)孕鼠血清內(nèi)的雄激素DHT，敵敵畏高中低劑量實(shí)驗(yàn)組的DHT濃度較對(duì)照明顯降低(P<0.01)，而敵敵畏各劑量組之間無統(tǒng)計(jì)差別(P>0.05)。 (3)免疫組化：PCNA：對(duì)照組尿道表達(dá)較DDVP明顯，標(biāo)明正常尿道粘膜增生更明顯；睪丸，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無差別，均為曲細(xì)精管內(nèi)精母細(xì)胞增生明顯，核蘭。Caspase-3：DDVP組尿道及睪丸表達(dá)均較對(duì)照略明顯。提示尿

7、道上皮凋亡活動(dòng)增強(qiáng)，尿道發(fā)育受到影響，睪丸內(nèi)leydig細(xì)胞和精母細(xì)胞凋亡增加，睪酮(T)的生成減少，相應(yīng)生理過程受限。AR：對(duì)照組的尿道和睪丸內(nèi)的表達(dá)均比DDVP組明顯增強(qiáng)，表明DDVP組尿道和睪丸內(nèi)的AR 下調(diào)，依賴雄激素的尿道發(fā)育生精過程等都可能會(huì)受到影響。ER：DDVP組與對(duì)照組間尿道和睪丸表達(dá)差別不明顯，表明ER相關(guān)過程受干擾不明顯。LHβ：DDVP組與對(duì)照組間尿道和睪丸表達(dá)差別不明顯，提示LH β相關(guān)過程受干擾不明顯。ARO

8、M：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間尿道和睪丸表達(dá)差別不明顯，表明此兩個(gè)部位的激素轉(zhuǎn)化過程未受到明顯影響。 結(jié)論： 1、成功建立尿道下裂大鼠模型，符合國(guó)際發(fā)育生殖毒性實(shí)驗(yàn)的規(guī)范，可成為進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。2、國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷類農(nóng)藥DDVP能類似雌激素誘導(dǎo)出哺乳動(dòng)物先天性尿道下裂畸形并用連續(xù)切片確證：DDVP有減輕雄性胎鼠體重和縮短AGD的作用。3、敵敵畏能降低孕鼠血清激素DHT水平，可能干擾雄性胎鼠體內(nèi)雄激素水平。4、DDVP對(duì)雄性

9、胎鼠的尿道、睪丸AR有下調(diào)作用，這與尿道凋亡活動(dòng)及胎睪內(nèi)免疫組化發(fā)現(xiàn)leydig細(xì)胞凋亡(Caspase-3表達(dá)增強(qiáng))增加相吻合，也與DDVP尿道增生活動(dòng)明顯弱于對(duì)照組相吻合(DDVP組尿道PCNA表達(dá)減弱)。5、在DDVP誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物發(fā)育生殖毒性的過程中，ER、LH β和AROM在兩組尿道和睪丸內(nèi)的表達(dá)無明顯差別，提示可能與ER、LHβ和AROM的作用關(guān)系不密切。具體機(jī)制還需在此研究基礎(chǔ)上，深入探索。 綜上所述，廣泛使用的有