有機磷農(nóng)藥-敵敵畏的發(fā)育生殖毒性及其機制的實驗研究.pdf

1、目的：建立并確證有機磷農(nóng)藥的代表-敵敵畏誘導(dǎo)先天性尿道下裂的大鼠模型，探討雄性哺乳動物先天性尿道下裂的病因，并研究廣泛使用的有機磷農(nóng)藥具有的發(fā)育生殖毒性進行研究。 方法： (1)敵敵畏(DDVP)誘導(dǎo)雄性大鼠先天性尿道下裂模型的建立和確定：初孕清潔級大鼠40只隨機分成4組：生理鹽水對照組10只，敵敵畏高、中、低劑量組各10只。根據(jù)預(yù)實驗指導(dǎo)，設(shè)敵敵畏5 mg／kg／d、1.25 mg／kg／d和0.625 mg／kg/d

2、三個劑量組。各組孕大鼠均在孕11天～18天，每晨管喂相應(yīng)藥物1.5ml～2ml一次，共連續(xù)管喂8次；停藥后待其孕20天(d20)的下午，從一側(cè)股血管放血處死孕鼠，剖開子宮，剔除胎盤、臍帶，在肉眼、解剖顯微鏡觀察雄性胎鼠觀察胎鼠外觀及外生殖器形態(tài)畸形變化，同時測量體長、肛生殖距離(AGD)，檢查吸收胎、活胎及晚死胎等，建成尿道下裂動物模型，對實驗組畸形、未發(fā)現(xiàn)畸形的雄性胎鼠和對照組的生殖腺逐一確定性別并取材，對其生殖結(jié)節(jié)固定，再進行5μm

3、連續(xù)組織橫斷切面，每200μm取出2張切片，HE染色后顯微鏡放大100～400倍拍照，確證雄性胎鼠尿道下裂畸形存在。 (2)先天性尿道下裂的病因?qū)W探討：取得三個實驗組和對照組所有孕鼠的全血，靜置后離心，得到約1．5ml血清，用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清雄激素雙氫睪酮(DHT)，檢測敵敵畏染毒對孕鼠性激素水平的影響。 (3)有機磷農(nóng)藥的發(fā)育生殖毒性的研究：有機磷農(nóng)藥-敵敵畏的三個實驗組和生理鹽水對照組的雄性胎鼠的生殖腺及尿生殖

4、結(jié)節(jié)固定包埋，明確陰莖方向后，垂直陰莖縱軸連續(xù)切片中，每200μm取出6張連片及各實驗組臨產(chǎn)雄性胎鼠性腺-睪丸包埋固定后分別切片，均行相應(yīng)的免疫組化方法檢測，探索激素ER，AR，LH，激素代謝酶AROM，增殖PCNA，凋亡因子CASEPASE-3在尿道周圍組織及睪丸組織細胞中表達有無差異，以了解有機磷農(nóng)藥的作用機制。 結(jié)果： (1)生理鹽水灌胃對照組未有雄性尿道下裂畸形胎鼠發(fā)生，敵敵畏5mg/kg/d、1．25 mg/k

5、g/d和0.625 mg/kg/d三個劑量組均誘導(dǎo)出仔代尿道下裂畸形，發(fā)生率分別為57.1％、33％和20.8％；敵敵畏各劑量組都有縮短臨產(chǎn)雄性胎鼠肛生殖距(AGD)的作用(P<0.05)；敵敵畏各劑量組可以明顯降低雄性胎鼠的體重(P<0.01)。對每組胎鼠均行解剖并確認性別，避免誤判。實驗組雄性尿道下裂胎鼠及對照組雄性胎鼠的陰莖進行連續(xù)組織切片，每200μm取出1張切片，HE染色照相，同距離切片對比能清楚看出尿道下裂胎鼠的陰莖腹側(cè)尿道

6、溝敞開，包皮缺損較對照組明顯長而寬。 (2)電化學(xué)發(fā)光法測定臨產(chǎn)孕鼠血清內(nèi)的雄激素DHT，敵敵畏高中低劑量實驗組的DHT濃度較對照明顯降低(P<0.01)，而敵敵畏各劑量組之間無統(tǒng)計差別(P>0.05)。 (3)免疫組化：PCNA：對照組尿道表達較DDVP明顯，標明正常尿道粘膜增生更明顯；睪丸，實驗組與對照組無差別，均為曲細精管內(nèi)精母細胞增生明顯，核蘭。Caspase-3：DDVP組尿道及睪丸表達均較對照略明顯。提示尿

7、道上皮凋亡活動增強，尿道發(fā)育受到影響，睪丸內(nèi)leydig細胞和精母細胞凋亡增加，睪酮(T)的生成減少，相應(yīng)生理過程受限。AR：對照組的尿道和睪丸內(nèi)的表達均比DDVP組明顯增強，表明DDVP組尿道和睪丸內(nèi)的AR 下調(diào)，依賴雄激素的尿道發(fā)育生精過程等都可能會受到影響。ER：DDVP組與對照組間尿道和睪丸表達差別不明顯，表明ER相關(guān)過程受干擾不明顯。LHβ：DDVP組與對照組間尿道和睪丸表達差別不明顯，提示LH β相關(guān)過程受干擾不明顯。ARO

8、M：實驗組與對照組間尿道和睪丸表達差別不明顯，表明此兩個部位的激素轉(zhuǎn)化過程未受到明顯影響。 結(jié)論： 1、成功建立尿道下裂大鼠模型，符合國際發(fā)育生殖毒性實驗的規(guī)范，可成為進一步研究的基礎(chǔ)。2、國際上首次發(fā)現(xiàn)有機磷類農(nóng)藥DDVP能類似雌激素誘導(dǎo)出哺乳動物先天性尿道下裂畸形并用連續(xù)切片確證：DDVP有減輕雄性胎鼠體重和縮短AGD的作用。3、敵敵畏能降低孕鼠血清激素DHT水平，可能干擾雄性胎鼠體內(nèi)雄激素水平。4、DDVP對雄性

9、胎鼠的尿道、睪丸AR有下調(diào)作用，這與尿道凋亡活動及胎睪內(nèi)免疫組化發(fā)現(xiàn)leydig細胞凋亡(Caspase-3表達增強)增加相吻合，也與DDVP尿道增生活動明顯弱于對照組相吻合(DDVP組尿道PCNA表達減弱)。5、在DDVP誘導(dǎo)哺乳動物發(fā)育生殖毒性的過程中，ER、LH β和AROM在兩組尿道和睪丸內(nèi)的表達無明顯差別，提示可能與ER、LHβ和AROM的作用關(guān)系不密切。具體機制還需在此研究基礎(chǔ)上，深入探索。 綜上所述，廣泛使用的有