Toll樣受體4在百草枯致小鼠急性多臟器功能損傷的作用.pdf

1、第一部分百草枯中毒致多臟器功能損傷小鼠模型的建立
　　目的：篩選合適的染毒劑量，建立百草枯中毒致多臟器功能損傷小鼠模型，初步探討百草枯中毒的劑量效應規(guī)律，為后期實驗做準備。方法:30只清潔級C57BL/6小鼠隨機分為五組，每組6只。A組：20mg/kg百草枯染毒組，B組：40mg/kg百草枯染毒組，C組：60 mg/kg百草枯染毒組，D組：80mg/kg百草枯染毒組,E組：100mg/kg百草枯染毒組。百草枯溶液腹腔注射染毒后第3

2、天時計算各組死亡率，做HE染色觀察肝、腎、肺組織損傷情況。
　　結果：20mg/kg百草枯染毒組小鼠染毒后3天小鼠無死亡，40mg/kg百草枯染毒組小鼠染毒后3天小鼠死亡率為16.7％，60mg/kg百草枯染毒組3天小鼠死亡率為33.3%，80mg/kg百草枯染毒組3天小鼠死亡率為83.3%，100mg/kg百草枯染毒組3天小鼠死亡率為100%。從病理學改變看，60mg/kg百草枯染毒組小鼠有明顯的肺、肝、腎損傷，而40mg/kg

3、百草枯染毒組有明顯的肺損傷改變，肝腎損傷不明顯。
　　結論：C57BL/6小鼠給予腹腔注射百草枯60mg/kg即可造成明顯肝、腎、肺組織損害。并且隨著小鼠腹腔注射百草枯的劑量增大，其存活率逐漸降低。
　　第二部分 Toll樣受體4在百草枯致小鼠急性多臟器功能損傷的作用
　　目的：探討Toll樣受體4(Toll-like receptor4,TLR4)基因敲除對小鼠急性百草枯（PQ）中毒血清、肺組織炎癥指標的影響，并且觀

4、察急性百草枯中毒后肝腎肺組織病理變化。
　　方法：野生型 C57BL小鼠和 Tlr4-/-C57BL小鼠分別隨機分為空白對照（NS）組，百草枯處理組。NS對照組給予生理鹽水60mg/kg腹腔注射，百草枯組給予百草枯60mg/kg腹腔注射。染毒后6h，24h，3d利用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE)染色法觀察小鼠肝腎肺組織病理改變，酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assa

5、y，ELISA)法測定血清中白介素–6(interleukin–6，IL–6)和白介素–1β(interleukin–1sβ，IL-1β)水平，Real-time PCR法測定肺組織白介素–1β(interleukin–1β，IL-1β)，IL–6 mRNA表達水平。
　　結果：野生型PQ組小鼠PQ染毒6小時血清IL-6水平和肺組織IL-6 mRNA水平即明顯升高，第24小時和第3天繼續(xù)升高，各時間點IL-6水平都明顯高于NS組(

6、P<0.01)；Toll4-/-PQ組小鼠PQ染毒6小時、24小時、3天血清和肺組織IL-6水平均較野生型小鼠低，有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，Toll4-/-PQ組小鼠各時間點血清 IL-6水平高于 NS組（P<0.01），而肺組織第6小時、24小時IL-6水平與NS組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，第3天肺組織IL-6水平高于NS組（P<0.05）。野生型PQ組小鼠PQ染毒后肺血清及肺組織6小時、24小時、3天I

7、L-1β水平持續(xù)升高，各時間點 IL-1β水平都高于 NS組(P<0.01)。Toll4-/-PQ組小鼠PQ染毒后第3天血清IL-1β水平較野生組小鼠明顯降低，而 Toll4-/-PQ組小鼠各時點肺組織IL-1βmRNA水平與野生型小鼠相比無明顯差異（p>0.05)。野生型PQ組小鼠至第3天時，肺泡腔塌陷、閉塞，肺泡間隔內大量紅細胞及炎性細胞浸潤；出現(xiàn)明顯的肝血竇擴張淤血，肝細胞呈水樣變性，有點片狀壞死；腎小球炎性細胞侵潤及纖維素滲出明

8、顯，部分腎小管細胞出現(xiàn)壞死。Toll4-/-PQ組小鼠染毒第3天肺泡間隔內大量紅細胞及炎性細胞浸潤，肺泡結構基本完整；肝細胞呈水樣變性，有點狀壞死；部分腎小球炎性細胞侵潤及腎小管細胞壞死，肝腎基本結構正常。
　　結論：TLR4基因敲除小鼠可以減少急性百草枯中毒后部分炎性因子血清 IL–6、IL–1β的釋放，并且肝、腎、肺組織的損害較野生型小鼠明顯減輕，延緩PQ導致的急性多臟器功能損傷的病理進程。
　　第三部分高遷移率蛋白在小

9、鼠急性百草枯中毒致急性肺損傷中的表達研究
　　目的：本實驗將在百草枯致小鼠急性多臟器功能損傷的模型上研究炎性因子高遷移率蛋白在血清中的含量變化和肺組織表達情況。
　　方法：野生型C57BL小鼠隨機分為空白對照（NS）組，百草枯處理組，NS對照組給予生理鹽水60mg/kg腹腔注射，百草枯組給予百草枯60mg/kg腹腔注射。染毒后6h，24h，3d利用免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)染色方法觀察小

10、鼠肝腎肺組織病理改變，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清中高遷移率蛋白-1(high-mobility group box1，HMGB1)的含量，R-T PCR法測定肺組織高遷移率蛋白mRNA表達情況。
　　結果：與生理鹽水組小鼠比較，百草枯染毒組小鼠染毒后6小時血清血清HMGB1水平即出現(xiàn)較明顯的升高(P<0.05)，第24小時和第3天繼續(xù)升高，各時間點HMGB1水平都明顯高于NS對照組(P<0.05)，NS對照組、PQ6h、

11、PQ24h以及PQ3d各組間的血清HMGB1水平有明顯差異，統(tǒng)計學意義顯著(P<0.05)。百草枯染毒后6小時即有肺組織HMGB1-mRNA表達升高，第24小時肺組織HMGB1-mRNA表達明顯增強，至染毒后第3天HMGB1-mRNA表達繼續(xù)增強。百草枯染毒組小鼠染毒后第24小時，肺泡上皮細胞和肺間質炎性細胞核 HMGB1-表達呈強陽性，可見部分細胞胞漿、胞外呈陽性，肺泡結構仍保持較好的完整性；第3天肺泡結構破壞、塌陷，上皮細胞和肺炎性