非小細(xì)胞肺癌分泌蛋白的定量研究.pdf

1、肺癌(lung cancer)是全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80-85％，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前，關(guān)于這類疾病的發(fā)病機(jī)理仍然不清楚，其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)理亟待闡明。近年來質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，為腫瘤研究提供了有力的研究手段。本實驗利用2D LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)平臺，結(jié)合同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric Tags for Relative andAbsolute Quantitati

2、on，iTRAQ）技術(shù)以及SWATHTM(Sequential WindowedAcquisition of all Theoretical fragment ions，SWATHTM)非標(biāo)記定量技術(shù)分析比較一對具有不同轉(zhuǎn)移潛能肺癌細(xì)胞系SPC-A-1 sci和SPC-A-1的差異分泌蛋白，篩選肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子。
　　第一部分:血清蛋白組分析方法的初步建立。利用安捷倫免疫親和色譜系統(tǒng)有效去除人血清中14個血清高豐度蛋白，有利于下一

3、步質(zhì)譜鑒定出更多血清低豐度蛋白，為之后的實驗研究奠定基礎(chǔ)。去除高豐度蛋白后的血清，利用iTRAQ標(biāo)記定量方法定量比較正常人與肺癌早期、中期及晚期病人的血清蛋白。
　　第二部分:NSCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)分泌蛋白的定量分析。利用iTRAQ標(biāo)記定量技術(shù)和SWATHTM非標(biāo)記定量技術(shù)同時分析SPC-A-1sci和SPC-A-1的差異分泌蛋白，并分析、整合兩種方法的定量效果，結(jié)果顯示在兩種方法中重復(fù)鑒定與定量的蛋白有326個，差異表達(dá)的蛋白110

4、個，經(jīng)過生物信息數(shù)據(jù)庫軟件預(yù)測，有96％的蛋白可通過分泌途徑分泌。應(yīng)用實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)與蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測差異蛋白在基因與蛋白水平的表達(dá)情況，結(jié)果與質(zhì)譜定量趨勢基本一致。
　　此外，運(yùn)用第一部分中蛋白組學(xué)分析血清的方法，比較早期肺癌病人組（Ⅰ和Ⅱ期）和晚期肺癌病人組（Ⅲ和Ⅳ期）的血清差異蛋白，共鑒定差異蛋白71個。ELISA檢測質(zhì)譜鑒定

5、結(jié)果中差異最顯著的蛋白(Complement C3)在血清樣本中的表達(dá)情況，結(jié)果與質(zhì)譜分析一致。結(jié)合血清和分泌上清的差異表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CD109同時在晚期肺癌病人和高轉(zhuǎn)移潛能肺癌細(xì)胞高表達(dá)，提示其可能與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有潛在研究價值。
　　第三部分:CD109表達(dá)量檢測及生物功能的初步研究。qRT-PCR檢測CD109在72對肺癌病人癌和癌旁組織中的表達(dá)，顯示CD109在癌組織中顯著增高，且在低分化肺癌組織中高表達(dá)。E