重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對脊髓損傷大鼠運動功能影響的實驗研究.pdf

1、研究背景:脊髓損傷(Spinal cord injury)是目前公認的疑難病之一,它具有高致殘率、高耗費及患者主要為青壯年等特點,對受害者是災(zāi)難性的事故。如何修復(fù)損傷脊髓及恢復(fù)損傷脊髓的功能目前仍沒有有效的對策,究其因為在于成熟中樞神經(jīng)再生困難,但近年來對脊髓損傷再生的一系列研究取得了令人鼓舞的結(jié)果。許多新的方法如重復(fù)經(jīng)顱磁刺激,神經(jīng)移植包括神經(jīng)干細胞移植、胚胎脊髓移植、周圍神經(jīng)移植,神經(jīng)營養(yǎng)因子,電刺激等均可使成年動物表現(xiàn)出某種程度的

2、恢復(fù)。其中重復(fù)經(jīng)顱磁刺激是一種無創(chuàng)無痛的新的治療方法。
　　 經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulate,TMS)是Barker等于1985年首先創(chuàng)立的一種皮層刺激方法,具有無痛、無損傷、操作簡便、安全可靠等優(yōu)點,很快得到臨床應(yīng)用。TMS是利用時變磁場作用于大腦皮層產(chǎn)生感應(yīng)電流改變皮層神經(jīng)細胞的動作電位,從而影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動的生物刺激技術(shù)。TMS的作用原理在于通過時變磁場誘發(fā)出感應(yīng)電場,具

3、體為一個快速電流脈沖通過刺激線圈,產(chǎn)生強的瞬間磁場,該磁場穿過顱骨,引起鄰近神經(jīng)組織產(chǎn)生繼發(fā)電流,局部神經(jīng)元發(fā)生去極化,從而產(chǎn)生生理效應(yīng)。
　　 經(jīng)顱磁刺激對于脊髓損傷的治療主要是改善脊髓損傷的運動功能,及各種并發(fā)癥的治療。其機制可能與經(jīng)顱磁刺激刺激大腦運動皮質(zhì),使運動區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生去極化,增強皮質(zhì)脊髓束的傳導(dǎo)作用,促進軸突的生長,從而改善運動功能。頻率是重復(fù)經(jīng)顱磁刺激的一個重要參數(shù),高頻或低頻對脊髓損傷運動功能的改善有無差異,

4、也需進一步研究。
　　 目的:研究重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對急性脊髓損傷大鼠運動功能的影響及其可能機制。
　　 方法:利用重物撞擊法制作T10脊髓損傷模型。利用改良的脊髓打擊器,將40g重錘從30cm落下打擊第10胸椎節(jié)段脊髓損傷大鼠36只。脊髓損傷模型制作:大鼠先以3.6％水合氯醛10ml/kg腹腔注射麻醉,俯臥位固定,背部剃毛備皮,常規(guī)消毒,定位于T10棘突位置,以此為中心做后背部正中切口,分離兩側(cè)椎旁肌肉,用血管鉗輕輕咬除T

5、10棘突和兩側(cè)椎板至關(guān)節(jié)突,充分暴露硬脊膜,將打擊器與脊髓接觸金屬頭輕輕接觸T10節(jié)段脊髓正中,使40g重錘放在撞擊器滑竿30cm處落下,大鼠出現(xiàn)一過性下肢抽動、下身回縮、尾巴擺動、雙下肢癱瘓,表明造模成功。逐層縫合椎旁肌肉和皮膚。術(shù)后保溫24h,每只大鼠皮下補液5ml,每天2次肌肉注射青霉素80000U,連續(xù)3天,防止泌尿感染,如果出現(xiàn)血尿繼續(xù)注射抗生素,直至血尿消失。每天早晚兩次人工按摩膀胱排尿,直至恢復(fù)反射性排尿為止。
　　

6、 48只SD大鼠隨機分為正常對照組、脊髓損傷對照組、高頻磁刺激組、低頻磁刺激組,每組12只。磁刺激組于手術(shù)后24h開始給予刺激,高頻組頻率為10Hz,低頻組頻率為1Hz,均為閾上刺激,500個脈沖,每天1次,連續(xù)8周,脊髓損傷對照組給予假刺激。分別于術(shù)后1天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周進行BBB(Basso Beatti and Bresnahan)行為學(xué)評分、檢測運動誘發(fā)電位(MEP),并于2周、4周時每組處死3

7、只大鼠,8周時處死全部大鼠,用HE染色觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化、并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測神經(jīng)絲蛋白(NF-200)表達變化。
　　 結(jié)果:1、大鼠行為學(xué)評分
　　 正常組為21分,穩(wěn)定無變化。經(jīng)重復(fù)測量方差分析,結(jié)果顯示組間差異顯著(F=1618.988,P=0.000),治療組比不治療組其BBB評分要高。不同時間點差異有顯著性(F=624.690,P=0.000),各組BBB評分變化與時間變化有關(guān)。治療方法與時間之間有交

8、互作用(F=72.598,P=0.000),提示不同治療方法隨時間的增加,BBB評分變化趨勢不同。進一步分析單獨效應(yīng),結(jié)果顯示各時間點內(nèi)各組間比較均有顯著性差異(P均=0.000),各組內(nèi)不同時間點間比較均有顯著性差異(P均=0.000)。正常組與其余3組在任何時間比均有顯著性差異(P均=0.000)。1天、1周時對照組、高頻組、低頻組間比較差異無顯著性(P均>0.05)。2周時對照組與高頻組比較差異有顯著性(P=0.000),對照組與

9、低頻組比較差異有顯著性(P=0.034),高頻組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.021)。4周時對照組與高頻組比較差異有顯著性(P=0.000),對照組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.000),高頻組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.024)。8周時對照組與高頻組比較差異有顯著性(P=0.000),對照組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.026),高頻組與低頻組比較差異有顯著性(P=0.013)。
　　 2、脊髓組織形態(tài)

10、r>　　 大體觀察:各組硬脊膜均完整,正常組脊髓完整光滑,脊髓損傷組損傷處可見脊髓表面黃染,脊髓明顯狹窄。
　　 400倍光鏡下觀察:正常組脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見腫脹改變,神經(jīng)元形態(tài)正常,核圓,可見核仁；脊髓損傷對照組脊髓組織結(jié)構(gòu)疏松,可見空洞形成,神經(jīng)元大量壞死。脊髓損傷高頻組、低頻組可見脊髓組織較為疏松,膠質(zhì)細胞增生,部分神經(jīng)細胞腫脹。
　　 3、免疫組化(NF-200陽性纖維占總面積百分比％)
　　

11、正常組神經(jīng)纖維排列最密集,脊髓損傷對照組神經(jīng)纖維排列最稀疏,僅見很少且短的神經(jīng)纖維；脊髓損傷磁刺激組神經(jīng)纖維密集程度介于正常組與脊髓損傷對照組之間,高頻組較低頻組神經(jīng)纖維排列稍密集。
　　 NF-200陽性纖維占總面積百分比經(jīng)析因方差分析顯示:不同時間點間比較(F=11.409,P=0.000)差異有顯著性,組間比較(F=172.941,P=0.000)差異有顯著性,時間和組間存在交互作用(F=4.736,P=0.001),提示

12、不同治療方法隨時間增加變化趨勢不同。進一步分析單獨效應(yīng),2周時組間比(F=151.415,P=0.000)差異有顯著性,正常組與其余3組比較P均=0.000差異有顯著性,高頻組與對照組比較P=0.222差異無顯著性,低頻組與對照組比較P=0.764.差異無顯著性,高頻組與低頻組比較P=0.141差異無顯著性。4周時組間比(F=127.725,P=0.000)差異有顯著性,正常組與其余3組比較P均=0.000差異有顯著性,高頻組與對照組比

13、較P=0.003差異有顯著性,低頻組與對照組比較P=0.020差異有顯著性,高頻組與低頻組比較P=0.194差異無顯著性；8周時組間比(F=65.211,P=0.000)差異有顯著性,正常組與其余3組比較P均=0.000,差異有顯著性,高頻組與對照組比較P=0.000差異有顯著性,低頻組與對照組比較P=0.000差異有顯著性,高頻組與低頻組比較P=0.013差異有顯著性。表明4周時治療組NF-200較脊髓損傷對照組高,8周時高頻組較低頻

14、組NF-200表達增高。
　　 4、運動誘發(fā)電位
　　 正常組運動誘發(fā)電位潛伏期最短,波幅最大；脊髓損傷對照組運動誘發(fā)電位潛伏期最長,波幅最小,幾乎不可見；脊髓損傷高頻組、低頻組潛伏期較正常組長,脊髓損傷對照組短,波幅較正常組明顯減小。
　　 對同一組內(nèi)不同時間點之間的檢測出運動誘發(fā)電位陽性率進行比較除了正常組不變外(100％),其余各組內(nèi)不同時間點之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.001,0.001,和0.