MicroRNA-190對(duì)人大腸癌細(xì)胞中DPC4基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的初步研究.pdf

1、目的:利用新生血管恢復(fù)缺血組織血液供應(yīng)以減少心肌損傷，恢復(fù)心功能，是治療缺血性心臟病的重要措施之一。大量研究表明，自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激具有心肌保護(hù)和促細(xì)胞分化作用。同時(shí)，有報(bào)道表明自噬參與缺氧誘導(dǎo)的血管新生過(guò)程。然而重要的血管生成誘導(dǎo)因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的血管新生是否與自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)并不清楚。本研究旨在探討自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在VEGF介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）管型形成中的作用。為以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬為靶點(diǎn)的血管生

2、成調(diào)控藥物的研發(fā)奠定相關(guān)理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:以不同濃度和時(shí)間VEGF處理培養(yǎng)的HUVEC為模型，采用二氫羅丹明(DHR123)染色分析活性氧(ROS)產(chǎn)生，采用免疫印跡、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物蛋白水平及mRNA水平表達(dá)，采用Matrigel分析內(nèi)皮細(xì)胞管型形成能力以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞遷移能力。同時(shí)采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制物、自噬抑制物以及自噬相關(guān)標(biāo)志物基因沉默技術(shù)觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬程度下調(diào)后對(duì)管型形成的

3、影響。以小鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎為心肌缺血模型，采用Westernblot檢測(cè)血管生成及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)分析血管生成標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:DHR123染色定量分析顯示VEGF促進(jìn)HUVEC中ROS產(chǎn)生，且呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間依賴性關(guān)系。同時(shí)，RT-PCR和免疫印跡分析顯示:VEGF促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因肌糖需求酶-1(IRE-1)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78/Bip)，自噬相關(guān)基因4(ATG4)，自噬

4、相關(guān)基因5（ATG5），Beclin-1(ATG6/Beclin-1) mRNA及蛋白表達(dá)，并在一定程度上呈現(xiàn)濃度及時(shí)間依賴性。利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)及Beclin-1將異性siRNA阻斷自噬發(fā)生后能顯著抑制100 ng/ml VEGF介導(dǎo)的HUVEC管型形成，降低細(xì)胞遷移能力。而且阻斷自噬發(fā)生，并不影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，其相應(yīng)的標(biāo)志物（IRE-1，Bip）仍處于高表達(dá)狀態(tài)。利用?；切苋パ跄懰徕c(TUDC)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

5、激，也同樣可以抑制VEGF介導(dǎo)的HUVEC形成管型的能力和細(xì)胞遷移能力，同時(shí)也抑制了自噬發(fā)生，其相應(yīng)標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ及Beclin-1的表達(dá)下降。整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血15天后小鼠心臟組織血管生成標(biāo)志物血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(VE-cadherin)表達(dá)增多，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)也增多。
　　結(jié)論:1.整體動(dòng)物水平顯示，缺血后血管生成與LC3-(Π)兀表達(dá)呈同向變化。2.細(xì)胞水平顯示VEGF通過(guò)誘導(dǎo)ROS生成，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)