miR-106b-93-25簇在子宮內(nèi)膜癌惡性表型中作用機制的研究.pdf

1、雌激素是由卵巢等組織分泌的類固醇激素，它通過與機體多種靶組織細(xì)胞中的受體結(jié)合，對生殖系統(tǒng)、乳腺、骨骼、神經(jīng)及心血管系統(tǒng)的發(fā)育和功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。雌激素在臨床上被用于預(yù)防和治療更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、心血管疾病等，但體內(nèi)長期高水平雌激素的刺激可導(dǎo)致許多組織的癌變。研究表明，雌二醇（estradiol，E2）及其部分代謝產(chǎn)物是誘發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的重要因素。而雌激素的作用與其受體密不可分。雌激素受體（ER）是甾醇類激素受體的一種，屬于核受

2、體超家族成員，定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。ER與其配體結(jié)合成為具有活性的轉(zhuǎn)錄因子，啟動多種基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡信號通路。ER的過表達(dá)與乳腺癌和一些婦科腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。成熟的ERα分子從氨基端到羧基端，由A—F六個結(jié)構(gòu)域組成。N端的A/B區(qū)為AF1（activation function）功能區(qū)，是高度可變區(qū)，參與受體對靶基因的反式轉(zhuǎn)錄激活；C區(qū)即高度保守的含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding do

3、main，DBD），是受體與DNA特異性結(jié)合及二聚化功能區(qū)；D區(qū)可與熱休克蛋白（HSP）結(jié)合，并具有核定位信號。C端的E/F區(qū)包含配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ligand-binding domain，LBD），具有與特異配體結(jié)合的特性及反式激活結(jié)構(gòu)域AF2（activation function-2）。AF1具有配體（雌激素）不依賴的轉(zhuǎn)錄激活功能，而AF2則具有配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活功能。AF1和AF2的有效轉(zhuǎn)錄激活依賴于ER與其他蛋白質(zhì)的相互作用。

4、這些與ER結(jié)合的蛋白質(zhì)被稱為ER共調(diào)節(jié)因子（coregulators），分為共激活因子（coactivators）和共抑制因子（corepressors）。當(dāng)ER與激素等配體結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生變化，形成穩(wěn)定的二聚體，并與DNA中具有回文結(jié)構(gòu)的特定元件（ERE）結(jié)合，隨后ER可以通過不同的輔激活因子與靶基因的轉(zhuǎn)錄元件相互作用，啟動基因轉(zhuǎn)錄。
　　由于雌激素與雌激素受體在婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展中所起到的重要作用，因此對于這類腫瘤的機制與治療

5、的研究也大多集中在如何逆轉(zhuǎn)雌激素的作用和/或通過雌激素受體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這也是本研究的目的與意義所在。
　　一、miR-106b-93-25簇在子宮內(nèi)膜癌惡性表型中作用機制的研究
　　以TAM（Tamoxifen）為代表的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（SERMs）在乳腺癌等腫瘤的治療中已被廣泛應(yīng)用，然而它們在不同組織中誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號、基因表達(dá)變化以及最終的生物學(xué)效應(yīng)顯著不同。TAM在有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的同時，卻增加了

6、子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的危險，其分子機制尚有待闡明。
　　ER與其配體結(jié)合后，可以募集多種共激活因子/共抑制因子形成復(fù)合體來共同調(diào)控基因的表達(dá)。這些復(fù)合體中的一些分子具有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HAT（histone acetyltransferase）活性，可以乙?；M蛋白。很多可逆的或不可逆HDAC抑制劑，如TSA（trichostatinA），能夠阻斷這一過程，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。一些研究已經(jīng)證實，在乳腺癌，TAM與ER結(jié)合后能與包含組蛋

7、白去乙?；富钚缘墓惨种茝?fù)合體相互作用，從而導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和基因沉默。
　　MicroRNA（miRNA）是由約22個核苷酸組成的非編碼的小分子RNAs。它們能夠在轉(zhuǎn)錄后水平，通過與靶基因mRNA的互補結(jié)合負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，因此miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能起到抑癌基因或是癌基因的作用。
　　實驗證實，TSA作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ECC-1和HEC-1A后，細(xì)胞增殖能力明顯減

8、弱；流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，TSA作用后的細(xì)胞與對照相比發(fā)生顯著的G1期阻滯，細(xì)胞凋亡也明顯增加。進(jìn)而，對TAM單獨或聯(lián)合應(yīng)用TSA刺激的ECC-1細(xì)胞系進(jìn)行了microRNA芯片分析。分析結(jié)果顯示，TAM和TSA聯(lián)合應(yīng)用組與對照組相比microRNA106b-25-93簇的表達(dá)明顯下調(diào)，而TAM單獨應(yīng)用組與對照組相比該miRNA簇?zé)o明顯變化。進(jìn)一步的實驗顯示TSA能夠下調(diào)miR-106b-25-93簇及其宿主基因MCM7的表達(dá)。因此推測T

9、SA對miR-106b-25-93簇的表達(dá)具有間接調(diào)控作用。
　　將人工合成的miR-106b、miR-93和miR-25及其抑制劑miR-106bInhibitor、miR-93Inhibitor和miR-25Inhibitor分別轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ECC-1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-106bInhibitor的細(xì)胞與對照組相比，發(fā)生了明顯的G1期阻滯，在轉(zhuǎn)染miR-93Inhibitor的細(xì)胞也出現(xiàn)了相似的結(jié)果，而轉(zhuǎn)染了miR-25

10、Inhibitor的細(xì)胞與對照組比較凋亡率增加。該結(jié)果說明miR-106b-25-93簇在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中具有抑制凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。實驗中，我們構(gòu)建了細(xì)胞周期激酶抑制蛋白p21和促凋亡蛋白Bim的3’UTR雙熒光素酶報告系統(tǒng)，通過與miRNA分子的共同轉(zhuǎn)染，證實p21和Bim分別是miR-106b和miR-25調(diào)控的靶基因。TSA刺激子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞引起miR-106b-25-93簇表達(dá)下調(diào)，因而解除了后者對p21和Bim表達(dá)的抑

11、制，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。Westernblot檢測證實，TSA能夠通過對miRNA簇的調(diào)節(jié)上調(diào)靶基因p21和Bim的表達(dá)。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，該miRNA簇的啟動子區(qū)存在c-Myc的結(jié)合位點，我們的實驗也證實了c-Myc的這一調(diào)控作用。而TSA對于c-Myc蛋白的下調(diào)作用也由Westernblot得到證實。
　　綜上所述，我們通過體外實驗及臨床標(biāo)本的檢測證實，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中存在一個調(diào)控通路：c-Myc能夠促進(jìn)mi

12、R-106b-93-25簇及其宿主基因MCM7的表達(dá)，而miR-106b-93-25簇通過抑制p21與Bim促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。TSA可以下調(diào)c-Myc的表達(dá)，從而間接實現(xiàn)了對miR-106b-25-93簇及其宿主基因MCM7的調(diào)控，引起細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡。該調(diào)控通路的發(fā)現(xiàn)，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供了新的方向和理論依據(jù)。
　　二、雌激素受體與Caspase-8融合基因修飾乳腺癌細(xì)胞凋亡的分子機制研究
　　

13、細(xì)胞凋亡作為一種自發(fā)的程序化的死亡過程，在多細(xì)胞生物的組織分化、器官發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)的維持中有著重要意義，并參與多種疾病的病理過程。半胱天冬酶（caspase）是不同凋亡途徑中共同的末端蛋白酶，caspase在細(xì)胞中以酶原形式存在，包含1個N端原結(jié)構(gòu)域（prodomain）、大亞基和小亞基。在上游凋亡信號作用下，caspases發(fā)生同源聚集發(fā)生交互切割而活化，游離的大、小亞基結(jié)合成活性caspase分子，廣泛作用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能蛋白，誘發(fā)

14、細(xì)胞凋亡。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，caspase可以通過多種信號途徑被激活。近年來的研究表明，在上游信號的誘導(dǎo)下，起始caspase分子相互接近，并形成同源二聚體是caspase活化的關(guān)鍵步驟。
　　ER在細(xì)胞中通常與熱休克蛋白HSP90結(jié)合而不具有轉(zhuǎn)錄激活活性，當(dāng)與激素等配體結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生變化，與HSP90解離，形成穩(wěn)定的二聚體，并與DNA中具有回文結(jié)構(gòu)的特定元件（ERE）結(jié)合，隨后ER可以通過不同的輔激活因子與靶基因的轉(zhuǎn)錄元件相互作

15、用，啟動基因轉(zhuǎn)錄。
　　綜上所述，將以caspase為主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的分子機制導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，并以一種可被小分子誘導(dǎo)的方式啟動該機制，可以選擇性地殺傷腫瘤細(xì)胞?；诖嗽O(shè)想，我們構(gòu)建了caspase8和ERα融合蛋白的真核表達(dá)載體，將其分別轉(zhuǎn)染并表達(dá)于ER陽性和陰性乳腺癌細(xì)胞，并篩選單克隆，建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。通過RT-PCR與Western blot證實了融合蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)。
　　為了驗證雌激素可以誘導(dǎo)融合蛋白

16、發(fā)生二聚化，我們又構(gòu)建了帶有FLAG和His標(biāo)簽的融合蛋白真核表達(dá)載體。間接免疫熒光實驗證實了當(dāng)有雌激素存在時，兩種標(biāo)簽的融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生共定位。而免疫共沉淀實驗和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳則直接驗證了雌激素誘導(dǎo)下的融合蛋白分子發(fā)生二聚化，形成二聚體。
　　穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了融合蛋白真核表達(dá)載體的ER陽性和ER陰性乳腺癌細(xì)胞，在雌激素誘導(dǎo)下均發(fā)生了細(xì)胞增殖減緩和細(xì)胞凋亡增加。在裸鼠的融合蛋白表達(dá)腫瘤模型，雌激素同樣表現(xiàn)出了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)