SK3在早期胚胎發(fā)育、子宮內(nèi)膜生長及子宮內(nèi)膜癌發(fā)病中的作用研究.pdf

1、第一部分：SK3在囊胚孵出中的作用及機制
　　 目的：證實SK3在植入前胚胎的表達，探討SK3在囊胚孵出中的作用及其機制。
　　 材料和方法：首先收集臨床上進行IVF/ICSI治療并成功懷孕病人剩余需要銷毀的胚胎進行體外培養(yǎng)，檢測SK3表達水平與孵出之間的關(guān)系。然后用小鼠胚胎進行機制探討。收集小鼠植入前胚胎，用RT-PCR、定量real-time PCR、western-blot和免疫熒光的方法檢測SK3在胚胎上的表達。

2、用SK3特異的siRNA采用顯微注射的方法進行體外敲除，應(yīng)用實時圖像分析結(jié)合膜片鉗技術(shù)觀察滋養(yǎng)細胞內(nèi)鈣、膜電位的變化；以及體外培養(yǎng)觀察卵裂和囊胚孵出情況。并應(yīng)用免疫熒光的方法了解F-actin的組裝。
　　 結(jié)果：人類胚胎孵出失敗的囊胚SK3表達水平較低。小鼠胚胎受精后從2細胞階段開始表達并逐漸增加，至囊胚階段明顯增加，并開始定位于胞膜上。SK3體外敲除的胚胎滋養(yǎng)細胞在毒胡蘿卜素(TG)刺激下細胞內(nèi)鈣上升幅度明顯減小，膜電位超級

3、化幅度也明顯減少。SK3敲除不影響卵裂和囊胚形成卻明顯影響囊胚的孵出，而且SK3敲除也使滋養(yǎng)細胞F-actin的組裝也明顯減少。
　　 結(jié)論：SK3在植入前胚胎有表達并在囊胚階段開始有功能。SK3可能通過影響囊胚滋養(yǎng)細胞內(nèi)鈣水平而影響F-actin的組裝，從而影響滋養(yǎng)細胞在孵出時的運動而影響囊胚孵出。
　　 第二部分：SK3在子宮內(nèi)膜細胞遷移中的作用及機制
　　 目的：證實SK3在人子宮內(nèi)膜上皮細胞表達，了解SK

4、3表達水平與內(nèi)膜厚度和形態(tài)之間的關(guān)系，并進一步探討SK3在子宮內(nèi)膜上皮細胞功能中的作用機制。
　　 材料和方法：采用定量real-timePCR方法檢測SK3在人類子宮內(nèi)膜的表達及表達水平與子宮內(nèi)膜厚度和形態(tài)的相關(guān)性。應(yīng)用蛋白半定量的方法探討子宮內(nèi)膜SK3蛋白表達水平與IVF治療過程中妊娠結(jié)局的關(guān)系。應(yīng)用RT-PCR、western-blot和免疫熒光的方法檢測SK3在正常內(nèi)膜的表達。應(yīng)用SK3特異的siRNA轉(zhuǎn)染的方法建立人子

5、宮內(nèi)膜上皮細胞體外敲除模型。應(yīng)用實時圖像分析結(jié)合膜片鉗技術(shù)檢測SK3體外敲除后細胞內(nèi)鈣和膜電位的變化。體外培養(yǎng)情況下檢測雌孕激素對子宮內(nèi)膜上皮細胞SK3表達的影響。觀察體外敲除后細胞遷移能力的變化以及F-actin的組裝情況。體外培養(yǎng)結(jié)合實時圖像分析以及免疫共沉淀技術(shù)，探討SK3是否參與了cAMP激活的鈣離子介導(dǎo)的張力蛋白組裝。
　　 結(jié)果：研究證實SK3在內(nèi)膜上皮細胞有表達，而且表現(xiàn)為在增殖期高表達而在分泌期低表達。內(nèi)膜活檢也

6、證實SK3表達水平與內(nèi)膜厚度相關(guān)，即內(nèi)膜厚度越薄SK3表達水平越低，而且相同厚度情況下，SK3表達水平無明顯三線征內(nèi)膜較三線征明顯的內(nèi)膜低。IVF治療中妊娠失敗的病人內(nèi)膜SK3蛋白表達水平較成功妊娠病人低。體外敲除實驗證實，在SK3體外敲除細胞毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣升高幅度降低，與此同時膜電位超極化幅度也降低。研究還表明，雌激素可以呈濃度依賴性上調(diào)SK3的表達，而孕激素則可以抑制雌激素的上調(diào)作用。此外，SK3體外敲除可以明顯抑制細胞的

7、遷移能力，并可以抑制F-actin的組裝。在SK3體外敲除細胞，8-pMeOPT誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣上調(diào)明顯降低，而且8-pMeOPT誘導(dǎo)的細胞遷移也明顯降低，S100A4與MHCⅡA的結(jié)合也明顯減少。
　　 結(jié)論：SK3在子宮內(nèi)膜上皮細胞表達，并通過影響cAMP激活的鈣通路參與了細胞遷移過程。SK3的低表達可以抑制子宮內(nèi)膜生長過程中的上皮細胞遷移，這可能是不能形成正常內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的原因。也可能是臨床上內(nèi)膜較薄和形態(tài)異常導(dǎo)致低妊娠率的原因

8、之一。
　　 第三部分：SK3在子宮內(nèi)膜腺癌細胞運動中的作用及機制
　　 目的：證實SK3在子宮內(nèi)膜癌中表達，了解SK3的表達水平及其與內(nèi)膜癌細胞功能之間的關(guān)系。進一步探討SK3在雌激素誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜腺癌細胞侵襲浸潤過程中的作用和機制。
　　 材料和方法：RT-PCR的方法證實SK3在子宮內(nèi)膜腺癌組織肌細胞系表達。定量real-timePCR和western-blot的方法檢測癌組織的表達水平，及不同分化程度細胞

9、系表達水平。采用western-blot的方法了解體外培養(yǎng)條件下雌激素對IK細胞SK3表達的調(diào)節(jié)。應(yīng)用SK3特異的siRNA轉(zhuǎn)染的方法建立IK細胞體外敲除模型。采用劃痕試驗、侵襲實驗探討SK3體外敲除后細胞遷移侵襲能力的變化。采用免疫熒光技術(shù)和Dio染色技術(shù)觀察SK3體外敲除后F-actin的組裝情況和細胞形態(tài)的變化。分別應(yīng)用雌激素核受體抑制劑ICI182780和膜受體抑制劑G15處理細胞，用western-blot的方法檢測SK3的表

10、達情況，了解雌激素對SK3表達調(diào)節(jié)方式。實時圖像分析技術(shù)探討SK3在雌激素膜受體誘導(dǎo)的細胞遷移過程中作用機制。用western-blot的方法對鈣通路下游與細胞運動有關(guān)的激酶活性進行檢測。
　　 結(jié)果：SK3在子宮內(nèi)膜癌組織高表達，不同的細胞系中，隨著細胞的分化程度降低SK3表達水平增高。雌激素可以呈濃度依賴性地上調(diào)SK3的表達。SK3體外敲除可以抑制雌激素誘導(dǎo)的細胞遷移和侵襲，并可以抑制雌激素誘導(dǎo)的F-actin的重組并使細胞