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文檔簡介
1、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,內(nèi)異癥)是指子宮內(nèi)膜在子宮腔以外的部位出現(xiàn)、生長、浸潤、周期性出血,或引起疼痛、不育及結(jié)節(jié)包塊等。近年來此病的發(fā)病率不斷上升,已成為第二位的婦科常見多發(fā)病。此病性質(zhì)良性而行為類似惡性疾病。內(nèi)異癥自1860年首次發(fā)現(xiàn)至今發(fā)病機制仍不清楚,造成此病治療的困難,臨床處理十分棘手。因此對內(nèi)異癥發(fā)病機制的深入研究,尋找新的、提高療效的治療方法十分必要。目前內(nèi)異癥的發(fā)病機制仍以內(nèi)膜細(xì)胞隨經(jīng)血逆流種植為主導(dǎo)
2、理論,近年來的研究認(rèn)為內(nèi)異癥是一種典型的炎癥相關(guān)性疾病。腹腔局部微環(huán)境炎癥反應(yīng)對異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的種植和增殖起非常重要的作用。 核因子κB(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的重要轉(zhuǎn)錄因子,是多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交匯點,廣泛參與機體免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)等生理及病理過程。NF-κB可高效誘導(dǎo)多種前炎性細(xì)胞因子(包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8)、白細(xì)胞粘附分子、單核細(xì)胞趨化因子等基因的表達(dá),同時對參與炎癥級聯(lián)及放大效應(yīng)的多種酶
3、的基因轉(zhuǎn)錄也具有重要的調(diào)控作用。NF-κB的過度激活可引起一系列炎癥相關(guān)性疾病,如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎、癌癥等,已經(jīng)引起人們的高度重視。目前國內(nèi)外關(guān)于NF-κB在內(nèi)異癥發(fā)病機制中作用的研究甚少。本課題通過體外分離培養(yǎng)內(nèi)異癥患者的異位、在位及非內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞,觀察前炎性細(xì)胞因子TNF-α對各組內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響,及其影響與細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化、分泌IL-8的情況之間的關(guān)系,NF-κB信號傳導(dǎo)阻斷劑TP
4、CK和抗IL-8的抗體對TNF-α作用的影響。為進(jìn)一步闡明NF-κB在內(nèi)異癥發(fā)病機制中的作用及探索內(nèi)異癥新的生物治療提供理論依據(jù)。 第一部分:分離純化及體外培養(yǎng)人異位及在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞。目的:建立分離純化及體外培養(yǎng)內(nèi)異癥患者的異位、在位及非內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的方法。方法:通過酶解、篩網(wǎng)過濾、傳代及貼壁純化等技術(shù),分離20例內(nèi)異癥患者的異位、在位及20例非內(nèi)異癥患者的在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果:內(nèi)
5、異癥及非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜分離培養(yǎng)的成功率明顯高于內(nèi)異癥異位內(nèi)膜(P<0.05)。內(nèi)異癥異位內(nèi)膜培養(yǎng)成功率低主要與取材有關(guān),標(biāo)本應(yīng)盡量取自囊壁新鮮出血區(qū)及血管豐富處的內(nèi)襯組織。經(jīng)篩網(wǎng)分離及傳代能明顯提高間質(zhì)細(xì)胞的純度。經(jīng)篩網(wǎng)分離及貼壁純化能明顯提高腺上皮細(xì)胞的純度。結(jié)論:通過酶解、篩網(wǎng)過濾、傳代及貼壁純化等技術(shù)能夠獲得高純度的內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。 第二部分:NF-κB在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中作用的研究。目的:前炎性細(xì)胞因子T
6、NF-α對體外培養(yǎng)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的影響;探索NF-κB的激活與內(nèi)異癥發(fā)生、發(fā)展是否存在聯(lián)系及尋找新的、更有效的治療途徑。方法:以TNF-α(0-100ng/ml)對體外分離培養(yǎng)內(nèi)異癥異位、在位及非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行干預(yù),采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測TNF-α對各組內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響,采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)檢測TNF-α對各組內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌IL-8情況的影響,用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同干預(yù)下各組內(nèi)
7、膜間質(zhì)細(xì)胞NF-κB活性的改變。觀察NF-κB信號傳導(dǎo)阻斷劑TPCK和抗IL-8的抗體對TNF-α作用的影響。結(jié)果:(1)TNF-α對內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞有明顯促增殖作用,且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。而對非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞則無明顯促增殖作用(P>0.05);(2)在TNF-α作用后內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-8的含量明顯增加,且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05),而非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-
8、8的含量則無明顯變化(P>0.05)。同時可見在相同的處理下內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-8的含量明顯高于非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜(P<0.05)(3)NF-κBp65免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均有表達(dá),以胞質(zhì)為主。而非內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞僅少數(shù)胞質(zhì)有表達(dá),胞核無表達(dá)。TNF-α能顯著誘導(dǎo)內(nèi)異癥異位及在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化,這種作用能被TPCK所抑制。TPCK能明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)異
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