miR-21在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)P53的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌指原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來(lái)源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見(jiàn)，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女多發(fā)。其作為女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占女性全身惡性腫瘤的7％，女性生殖道惡性腫瘤的20％～30％。近年國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢(shì)，但其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確?；顧z雖是目前診斷子宮內(nèi)膜癌唯一的金標(biāo)準(zhǔn)，可它卻是一項(xiàng)侵入性檢查，所以我們急需一個(gè)可早期診斷子宮內(nèi)膜癌的方法。microRNA是一類(lèi)廣泛存在

2、于真核細(xì)胞中的長(zhǎng)約22nt的單鏈非編碼RNA，其通過(guò)與miRNA完全或不完全的互補(bǔ)使靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡。miRNA可通過(guò)類(lèi)似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化過(guò)程。其中當(dāng)屬對(duì)miR-21的研究最為熱門(mén)，目前研究發(fā)現(xiàn)其可能參與了細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。P53是當(dāng)今研究最為廣泛的人類(lèi)腫瘤抑制基因。P53蛋白與DNA多聚酶結(jié)合，可使復(fù)制起始復(fù)合物失

3、活，從而抑制腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖。P53突變導(dǎo)致該基因過(guò)度表達(dá)，這種異常過(guò)度表達(dá)往往與子宮內(nèi)膜癌臨床分期、組織分級(jí)、肌層侵蝕度密切相關(guān)。本研究旨在通過(guò)觀察抑制miR-21的表達(dá)后子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖與凋亡的情況，及其P53在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)，并探討二者在子宮內(nèi)膜癌中的作用關(guān)系，以發(fā)現(xiàn)miRNA-21在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，為其診斷和治療提供新的靶標(biāo)。
　　 方法:
　　 1培養(yǎng)

4、子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株。
　　 2實(shí)驗(yàn)分組:①實(shí)驗(yàn)組即應(yīng)用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-21的特異性抑制劑反義寡核苷酸組;②陰性對(duì)照組即轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)miR-21的特異性抑制劑核苷酸序列組;③脂質(zhì)體對(duì)照組即轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組;④空白對(duì)照組即不轉(zhuǎn)染組。
　　 3CCK-8法檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖情況。
　　 4流式細(xì)胞

5、學(xué)方法檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡情況。
　　 5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中miRNA21和P53mRNA的表達(dá)水平。
　　 6Westernblot檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中P53蛋白表達(dá)的情況。
　　 7用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜

6、0.05為具有顯著性差異。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:
　　 1經(jīng)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染24h、48h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率:24h后實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組孔中均有弱熒光表達(dá)，48h后熒光表達(dá)均增強(qiáng)（轉(zhuǎn)染率70％～85％）。
　　 2CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):四組細(xì)胞整體呈增殖趨勢(shì)，0-24h，空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組增殖速度相似，比實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組略快;24-48h，

7、空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組增殖速度較快;48-72h，增殖速度:脂質(zhì)體對(duì)照組＞空白對(duì)照組＞實(shí)驗(yàn)組＞陰性對(duì)照組;72-96h，四組細(xì)胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)，且達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組增殖速度稍快。各組之間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。
　　 3細(xì)胞轉(zhuǎn)染3天后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體和陰性對(duì)照組比較早期凋亡所占的比例明顯偏低，各組之間比較有顯著性差異（P＜0.05

8、）。實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體和陰性對(duì)照組比較晚期凋亡細(xì)胞所占比例相似，各組之間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　 4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA21和P53mRNA的表達(dá)水平:與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組miR-21的表達(dá)量下調(diào)了40％左右，也明顯低于其他各組，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。相對(duì)于空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組P53mRNA的表達(dá)量明顯降低，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。

9、
　　 5通過(guò)WesternBlot檢測(cè)P53蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組P53蛋白的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組及脂質(zhì)體對(duì)照組，并且與各組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中有miR-21表達(dá)，miR-21抑制劑能有效抑制其在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2miR-21能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡，而對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。
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