miR-21在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中的表達及其對P53的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌指原發(fā)于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見，圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后婦女多發(fā)。其作為女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占女性全身惡性腫瘤的7％，女性生殖道惡性腫瘤的20％～30％。近年國外流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢，但其病因及發(fā)病機制尚不明確。活檢雖是目前診斷子宮內(nèi)膜癌唯一的金標準，可它卻是一項侵入性檢查，所以我們急需一個可早期診斷子宮內(nèi)膜癌的方法。microRNA是一類廣泛存在

2、于真核細胞中的長約22nt的單鏈非編碼RNA，其通過與miRNA完全或不完全的互補使靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化和凋亡。miRNA可通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化過程。其中當屬對miR-21的研究最為熱門，目前研究發(fā)現(xiàn)其可能參與了細胞的分化、增殖和凋亡，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。P53是當今研究最為廣泛的人類腫瘤抑制基因。P53蛋白與DNA多聚酶結(jié)合，可使復(fù)制起始復(fù)合物失

3、活，從而抑制腫瘤細胞過度增殖。P53突變導(dǎo)致該基因過度表達，這種異常過度表達往往與子宮內(nèi)膜癌臨床分期、組織分級、肌層侵蝕度密切相關(guān)。本研究旨在通過觀察抑制miR-21的表達后子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖與凋亡的情況，及其P53在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中的表達，并探討二者在子宮內(nèi)膜癌中的作用關(guān)系，以發(fā)現(xiàn)miRNA-21在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為其診斷和治療提供新的靶標。
　　 方法:
　　 1培養(yǎng)

4、子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株。
　　 2實驗分組:①實驗組即應(yīng)用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-21的特異性抑制劑反義寡核苷酸組;②陰性對照組即轉(zhuǎn)染無關(guān)miR-21的特異性抑制劑核苷酸序列組;③脂質(zhì)體對照組即轉(zhuǎn)染LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組;④空白對照組即不轉(zhuǎn)染組。
　　 3CCK-8法檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖情況。
　　 4流式細胞

5、學(xué)方法檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞凋亡情況。
　　 5實時定量PCR檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中miRNA21和P53mRNA的表達水平。
　　 6Westernblot檢測各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中P53蛋白表達的情況。
　　 7用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜

6、0.05為具有顯著性差異。所有實驗均重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:
　　 1經(jīng)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染24h、48h后，用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率:24h后實驗組及陰性對照組孔中均有弱熒光表達，48h后熒光表達均增強（轉(zhuǎn)染率70％～85％）。
　　 2CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn):四組細胞整體呈增殖趨勢，0-24h，空白對照組和脂質(zhì)體對照組增殖速度相似，比實驗組和陰性對照組略快;24-48h，

7、空白對照組、脂質(zhì)體對照組和實驗組增殖速度較快;48-72h，增殖速度:脂質(zhì)體對照組＞空白對照組＞實驗組＞陰性對照組;72-96h，四組細胞繼續(xù)保持增殖狀態(tài)，且達到對數(shù)生長期，空白對照組、脂質(zhì)體對照組和實驗組增殖速度稍快。各組之間比較無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 3細胞轉(zhuǎn)染3天后，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染對細胞凋亡的影響:實驗組與空白對照組、脂質(zhì)體和陰性對照組比較早期凋亡所占的比例明顯偏低，各組之間比較有顯著性差異（P＜0.05

8、）。實驗組與空白對照組、脂質(zhì)體和陰性對照組比較晚期凋亡細胞所占比例相似，各組之間比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 4實時定量PCR檢測miRNA21和P53mRNA的表達水平:與空白對照組相比，實驗組miR-21的表達量下調(diào)了40％左右，也明顯低于其他各組，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。相對于空白對照組和脂質(zhì)體對照組，實驗組和陰性對照組P53mRNA的表達量明顯降低，與各組間比較有顯著性差異(P＜0.05)。

9、
　　 5通過WesternBlot檢測P53蛋白表達，實驗組P53蛋白的表達量明顯高于陰性對照組、空白對照組及脂質(zhì)體對照組，并且與各組間比較有顯著性差異（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中有miR-21表達，miR-21抑制劑能有效抑制其在細胞中的表達。
　　 2miR-21能夠促進子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞凋亡，而對細胞的增殖無明顯影響。
　　 3P5