SELDI蛋白芯片技術(shù)篩選乙肝后肝硬化與原發(fā)性肝癌腹水蛋白標(biāo)記物的研究.pdf

1、在我國肝癌死亡率位居惡性腫瘤死亡率的第二位，死于肝癌的患者占全球肝癌死亡人數(shù)的53％。盡管肝癌的臨床診治及基礎(chǔ)研究均取得了豐碩的成果，但其總體預(yù)后并未得到顯著改善，難以早期診斷而失去手術(shù)時機(jī)是重要原因之一。雖然甲胎蛋白仍然是肝癌早期診斷的最好指標(biāo)，但其敏感度和特異性均不高，因此尋找一種簡單、快速、高靈敏度和高特異性的診斷方法已成為臨床醫(yī)學(xué)的迫切需要。 目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，生命科學(xué)研究重點(diǎn)已經(jīng)從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)移到蛋白

2、質(zhì)組學(xué)上來。其中表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)是近些年來興起的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，其具有高通量性及高靈敏度，為研究疾病的發(fā)生、發(fā)展以及其早期生物標(biāo)記物的檢測，提供了強(qiáng)有力的平臺，目前已用于多種疾病的檢測和診斷的研究。 本課題旨在利用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)檢測乙肝后肝硬化和原發(fā)性肝癌兩組患者的腹水，得到兩組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，分析比較兩組差異表達(dá)

3、蛋白并構(gòu)建相應(yīng)的診斷模型(pattern)，以其能從腹水中篩選乙肝后肝硬化患者和原發(fā)性肝癌患者蛋白質(zhì)標(biāo)志物及發(fā)現(xiàn)可以用于乙肝后肝硬化患者和原發(fā)性肝癌患者診斷的蛋白質(zhì)組學(xué)構(gòu)型，并為進(jìn)一步研究提供線索和新的思路。 第一部分蛋白芯片及的選擇 目的：從CM10、IMAC3-Cu這兩種芯片中選擇合適應(yīng)用于乙肝后肝硬化和原發(fā)性肝癌患者腹水蛋白質(zhì)指紋圖譜研究的芯片種類。 方法：選擇乙肝后肝硬化和原發(fā)性肝癌患者腹水各12例，采用

4、CM10、IMAC3-Cu兩種蛋白芯片，經(jīng)SELDI-TOF-MS技術(shù)測定蛋白質(zhì)譜，篩選檢測腹水蛋白的最佳芯片。 結(jié)果：在1000-50000Da范圍內(nèi)，CM10芯片在各實(shí)驗(yàn)組捕獲的蛋白峰數(shù)分別為：乙肝后肝硬化組103個；原發(fā)性肝癌組118個。IMAC3-Cu芯片在各實(shí)驗(yàn)組捕獲的蛋白峰數(shù)分別為：乙肝后肝硬化組53個；原發(fā)性肝癌組57個。 結(jié)論：CM10能得到更多的乙肝后肝硬化和原發(fā)性肝癌患者有顯著意義的差異蛋白峰值，能更

5、好的應(yīng)用于本課題的研究。 第二部分乙肝后肝硬化患者和原發(fā)性肝癌腹水蛋白標(biāo)記物篩選和診斷模型的建立 目的：尋找乙肝后肝硬化和原發(fā)性肝癌相關(guān)蛋白質(zhì)及治療靶點(diǎn)，初步構(gòu)建乙肝后肝硬化患者與原發(fā)性肝癌患者診斷模型，并探討其臨床應(yīng)用的可行性。 方法：收集30例乙肝后肝硬化患者、29例原發(fā)性肝癌患者新鮮腹水，經(jīng)分析選用Ciphergen公司的CM10芯片(弱陽離子芯片)，利用SELDI-TOF-MS技術(shù)對樣本進(jìn)行檢測，得到其蛋

6、白質(zhì)質(zhì)譜掃描譜，并采用CiphergenBiosystems軟件對上述兩組波譜進(jìn)行兩兩比較分析。 結(jié)果： 1、在乙肝后肝硬化患者組與原發(fā)性肝癌組比較中發(fā)現(xiàn)24個蛋白峰在兩組間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與乙肝后肝硬化患者腹水蛋白質(zhì)譜相比，原發(fā)性肝癌患者腹水中16個差異蛋白峰表達(dá)上調(diào)，8個差異蛋白峰表達(dá)下調(diào)。 2、軟件從這24個差異蛋白峰中選取6個有顯著差異的標(biāo)志蛋白組合樣式建立診斷模型，其模型雙盲驗(yàn)證

7、的準(zhǔn)確率為81.35％(48/59)，靈敏度為80.00％(24/30)，特異度為82.75％(24/29)，陽性預(yù)測值82.75％(24/29)，陰性預(yù)測值為80.00％(24/30)。 結(jié)論： 1、乙肝后肝硬化患者組與原發(fā)性肝癌組間腹水蛋白圖譜表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝細(xì)胞惡變可能在肝細(xì)胞再生過程中發(fā)生，即經(jīng)肝細(xì)胞損害引起再生或不典型增生，此過程可能與這16個表達(dá)上調(diào)的差異蛋白峰相關(guān)。 2、建立的診斷模型，能將