MePEG-PLGA納米粒長循環(huán)機制及載TNF-α拮抗肽性能研究.pdf

1、近年來，高分子納米載藥系統(tǒng)作為多肽、蛋白質(zhì)藥物載體展示了良好的臨床應(yīng)用前景，成為藥學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。但是，有關(guān)高分子納米載藥系統(tǒng)長循環(huán)機制的一些基礎(chǔ)科學(xué)問題尚待深入研究。本文采用開環(huán)聚合法合成了不同分子量的單甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸（MePEG-PLGA）兩嵌段共聚物，通過自乳化溶劑擴散法（SESD）制備了不同表面特性和粒徑MePEG-PLGA納米粒（MePEG-PLGA-NPs），較系統(tǒng)的研究了血清蛋白吸附、調(diào)理作用與MePEG

2、-PLGA-NPs表面MePEG修飾、粒徑之間的關(guān)系，巨噬細胞吞噬與MePEG-PLGA-NPs表面MePEG修飾、粒徑以及血清蛋白吸附、調(diào)理作用之間的關(guān)系，以闡明高分子納米載藥系統(tǒng)長循環(huán)機制。同時，制備了載TNF-α拮抗肽（TNF-BP）的MePEG-PLGA-NPs，并對其載藥性能、體外藥物釋放行為和生物活性等方面進行了研究。主要研究工作如下：
　　 (1)采用開環(huán)聚合法合成了MePEG-PLGA兩嵌段共聚物，利用凝膠滲透色

3、譜（GPC）測定聚合物分子量，利用FT-IR、1H-NMR表征共聚物的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：合成的聚合物分子量為38000Da，圖譜證實合成的MePEG-PLGA兩嵌段共聚物，純度較高。以合成的MePEG-PLGA為原料，通過SESD法制備MePEG-PLGA-NPs，以納米粒粒徑和表面Zeta電位為衡量指標，對影響納米粒特性的處方進行優(yōu)化，得到制備納米粒的優(yōu)化處方：乳化劑為0.2% Tween 80 (w/v)，有機相中MePEG-PL

4、GA濃度為8.0 mg/mL，有機相與外水相體積比為1:6。在該處方下，制備的納米粒粒徑為80.2±7.7 nm，表面Zeta電位為-24.55±3.50 mV，透射電鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）觀察到納米粒形態(tài)規(guī)整，分散性能好，具有很好的穩(wěn)定性。
　　 (2)以不同MePEG-PLGA聚合物為材料制備一系列MePEG-PLGA-NPs，利用BCA蛋白試劑盒分析、SDS-PAGE和ELISA等技術(shù)系統(tǒng)研究了納米粒表面Me

5、PEG鏈長、含量及粒徑對MePEG-PLGA-NPs吸附血清蛋白和激活補體的影響。研究表明：納米粒表面MePEG修飾后并隨其鏈長增加，顆粒表面BSA、IgG和血清總蛋白吸附量減少；MePEG含量由2.5%增至10.0%時，IgG吸附量逐漸下降，而BSA和血清總蛋白在MePEG含量為7.5%時，吸附量最低，隨MePEG含量進一步增加吸附量略有升高。納米粒MePEG修飾后，補體消耗減弱，MePEG含量為5.0-7.5%時，補體消耗程度最低。

6、通過檢測補體活化片段（iC3b和C4d），也證實MePEG修飾能降低納米粒激活補體的程度，并揭示了納米粒以經(jīng)典和旁路兩種途徑激活補體。MePEG-PLGA-NPs的粒徑也影響著血清蛋白在其表面的吸附、調(diào)理作用，隨著粒徑由73.6 nm增至405.1 nm，血清蛋白吸附和補體激活增強，當納米粒粒徑大于405.1 nm時，蛋白吸附和補體激活不再有明顯變化。
　　 (3)利用SESD法制備尼羅紅（nile red）標記納米粒，采用熒光

7、分光光度計和熒光顯微鏡分析巨噬細胞吞噬特性，研究了納米粒表面MePEG修飾、粒徑和血清蛋白吸附、調(diào)理對小鼠腹腔巨噬細胞體外吞噬MePEG-PLGA-NPs的影響。研究發(fā)現(xiàn)：巨噬細胞吞噬納米粒包括不依賴血清介導(dǎo)的吞噬和依賴血清介導(dǎo)的吞噬，MePEG修飾對不依賴血清介導(dǎo)吞噬的影響不明顯，而對依賴血清介導(dǎo)吞噬的影響是通過調(diào)控IgG、補體（經(jīng)典和旁路途徑）參與的調(diào)理作用來實現(xiàn)，隨著MePEG鏈長和含量增加，調(diào)理作用對巨噬細胞吞噬的影響逐漸減弱，

8、且細胞吞噬率逐漸降低，當MePEG含量超過7.5%時，MePEG鏈抑制巨噬細胞吞噬納米粒的作用不再有明顯變化。顆粒粒徑在納米和亞微米范圍內(nèi)，隨著粒徑增大，不依賴血清介導(dǎo)的吞噬逐漸降低，而依賴血清介導(dǎo)的吞噬增強，這兩方面作用使得微粒粒徑約為400 nm時，最易被巨噬細胞吞噬。
　　 (4)以MePEG-PLGA-NPs為載體，通過靜電吸附作用負載TNF-BP，探討了乳化劑種類、乳化劑濃度、聚合物濃度、投藥量和載藥介質(zhì)等因素對MeP

9、EG-PLGA-NPs載藥性能的影響，并對負載TNF-BP納米粒釋藥性能和生物活性進行了研究。結(jié)果表明：在優(yōu)化條件下納米粒的載藥量為1.36±0.05%，包封率為54.40±1.56%。MePEG-PLGA-NPs載藥量高，藥物釋放速率快；釋放介質(zhì)的離子強度低，藥物釋放速率減慢。MTT檢測結(jié)果證實納米粒釋放的TNF-BP仍具有較高的生物活性。
　　 本文研究結(jié)果表明，通過SESD可制得具有良好穩(wěn)定性的MePEG-PLGA-NPs

10、，納米粒表面MePEG修飾主要通過調(diào)控調(diào)理素（IgG和補體）和去調(diào)理素（BSA）在納米粒表面的吸附影響依賴血清介導(dǎo)的細胞吞噬特性，因而對巨噬細胞吞噬納米粒產(chǎn)生影響；粒徑對不依賴血清介導(dǎo)和依賴血清介導(dǎo)的巨噬細胞吞噬均有影響。MePEG-PLGA-NPs具有良好的載TNF-BP性能及一定的緩釋作用，釋放后藥物的生物活性較好。本文研究結(jié)果一定程度上揭示了納米載藥系統(tǒng)長循環(huán)機制，并為制備具有長循環(huán)特性的載多肽蛋白藥物納米載藥系統(tǒng)提供實驗依據(jù)。在