UTMD增強(qiáng)載Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞及視網(wǎng)膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、RNAi(RNA interference,RNAi)技術(shù)是一種特異、高效沉默基因的新方法,但小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染效率低,半衰期短、體循環(huán)中極易被降解,長(zhǎng)期穩(wěn)定生效必須借助載體。陽(yáng)離子聚合物制成的納米粒子做為新型的基因載體包裹DNA或RNA后,可有效增加核苷酸進(jìn)入細(xì)胞的量;保護(hù)核苷酸,使其免遭核酸酶的降解,增強(qiáng)穩(wěn)定性。本研究以生物可降解的三嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-聚

2、賴氨酸(monomethoxypoly(ethyleneglycol)-poly(lactic-co-glycolic acid)-poly L-lysine,mPEG-PLGA-PLL)為骨架,構(gòu)建包裹熒光分子探針Cy3標(biāo)記的siRNA載基因納米粒子。探討超聲輻照微泡造影劑SonoVue促進(jìn)載Cy3-siRNA納米粒子轉(zhuǎn)染鼠源性視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞和大鼠視網(wǎng)膜組織的可行性;

3、探索超聲靶向破壞微泡(ultrasound targeted microbubbledestruction,UTMD)的物理方法與生物可降解的納米粒載體聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)基因遞送的新途徑,并利用熒光分子探針精確定位納米粒子在細(xì)胞和活體內(nèi)的分布,揭示UTMD基因遞送系統(tǒng)增強(qiáng)載基因納米粒子遞送的可能分子生物學(xué)機(jī)制。主要包括以下四方面內(nèi)容:
　　第Ⅰ部分載Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒的制備與表征
　　目的:以生物

4、可降解三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL為骨架,構(gòu)建包裹熒光分子探針Cy3標(biāo)記的siRNA載基因納米粒子。并對(duì)其形態(tài)、粒徑大小及表面電荷分布進(jìn)行表征,檢測(cè)基因包封率和體外釋放規(guī)律。
　　方法:采用復(fù)乳法制備載Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒,掃描電鏡和電位/超細(xì)微粒粒度分析儀對(duì)所構(gòu)建的載基因納米粒進(jìn)行表征,高效液相色譜法測(cè)定納米粒子內(nèi)siRNA的包封率及體外釋放規(guī)律,瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察納米材料

5、與siRNA的結(jié)合能力。
　　結(jié)果:掃描電鏡證實(shí)載Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒呈球形,表面光滑,分布均勻;納米粒子的平均直徑是151±74 nm:Zeta電位為-0.13 mV,高效液相色譜測(cè)得包封率為86.06％,在10天內(nèi),納米粒子可以長(zhǎng)期穩(wěn)定的釋放siRNA,累計(jì)釋放量86.13±3.06％。當(dāng)三嵌段聚合物mPEG-PLGA-PLL與siRNA的比例為600:1時(shí),電泳阻滯實(shí)驗(yàn)顯示納米材料可以完全捆綁

6、siRNA。
　　結(jié)論:采用復(fù)乳法本實(shí)驗(yàn)成功合成了包載Cy3-siRNAmPEG-PLGA-PLL納米粒。納米粒的包載率和體外釋放規(guī)律,理論上能達(dá)到治療要求,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。
　　第Ⅱ部分載Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒體外基因沉默效果和細(xì)胞毒性
　　目的:探討所制備的mPEG-PLGA-PLL納米粒能否有效介導(dǎo)Cy3-siRNA分子轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的細(xì)胞,沉默靶基因的表達(dá),并考察其細(xì)胞毒性

7、。
　　方法:將穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的人肺癌細(xì)胞株SPC-A1-GFP以每孔1×105個(gè)接種于24孔培養(yǎng)板,利用mPEG-PLGA-PLL納米粒介導(dǎo)熒光分子探針Cy3標(biāo)記的GFP siRNA轉(zhuǎn)染SPC-A1-GFP細(xì)胞(納米粒子用量為0.6 mg/孔,濃度為1.2 mg/mL,包含siRNA0.8μg),并以攜帶相同量Cy3-GFP siRNA的脂質(zhì)體載體Lipofec

8、tamineTM2000及單純的siRNA為對(duì)照,加入轉(zhuǎn)染試劑后,每孔加入一定量不含胎牛血清的培養(yǎng)基,確保液體總量為500μl。轉(zhuǎn)染后12h,利用倒置熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)Cy3-GFPsiRNA的攝取,流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組SPC-A1-GFP細(xì)胞Cy3-GFPsiRNA攝取效率及熒光強(qiáng)度。轉(zhuǎn)染后48 h,使用倒置熒光顯微鏡觀察SPC-A1-GFP細(xì)胞綠色熒光蛋白的沉默效果,流式細(xì)胞儀檢測(cè)基因表達(dá)抑制效率。實(shí)時(shí)定量逆

9、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SPC-A1-GFP細(xì)胞內(nèi)GFPmRNA的變化,并用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法檢測(cè)納米粒子的細(xì)

10、胞毒性。
　　結(jié)果:流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示載Cy3-GFP siRNA納米粒子組細(xì)胞Cy3-siRNA攝取率明顯高于Lipofectamine-siRNA復(fù)合物組(92.17±2.54％vs74.63±3.84％),二者之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。而單純siRNA組細(xì)胞漿內(nèi)僅觀察到少量的Cy3-siRNA,攝取率為9.33±2.55％。轉(zhuǎn)染48 h后,載GFP siRNA納米粒子組基因沉默效率為33.71％,而Lipo

11、fectamine-siRNA組為25.42％,兩組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004)。RT-PCR分析結(jié)果顯示,載Cy3-GFP siRNA納米粒子組較其它實(shí)驗(yàn)組具有更高的抑制效能,GFP mRNA轉(zhuǎn)錄抑制率為56.33％,明顯高于Lipofectamine-siRNA組的43.72％(P=0.006),而單純Cy3-GFPsiRNA組沒有明顯的基因沉默效果。MTT結(jié)果顯示載siRNA納米粒子組細(xì)胞生長(zhǎng)受到輕度抑制,存活率為89.

12、64±3.20％,Lipofectamine-siRNA組細(xì)胞存活率降低更為明顯為86.39±2.84％,兩者比較無(wú)顯著差異(P=0.268),但均低于對(duì)照組(P=0.005;P=0.001)。
　　結(jié)論:與LipofectamineTM2000相比,mPEG-PLGA-PLL納米粒具有更高的siRNA遞送和基因沉默效能,高濃度狀態(tài)下細(xì)胞毒性較低,表明生物可降解的三嵌段共聚物mPEG-PLGA-PLL納米?？梢宰鳛榘踩行У姆遣《?/p>

13、載體增強(qiáng)siRNA的遞送和基因沉默效果。
　　第Ⅲ部分超聲輻照微泡造影劑SonoVue促進(jìn)載Cy3-PDGF BBsiRNA納米粒轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討超聲和/或微泡造影劑SonoVue促進(jìn)載Cy3-PDGF BB siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒轉(zhuǎn)染RPE-J細(xì)胞的可行性。
　　方法:0.1 mg/mL的載Cy3-siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒與RPE-J細(xì)胞一起孵育,不同

14、超聲和/或微泡造影劑SonoVue轉(zhuǎn)染條件下,利用倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀觀察測(cè)定細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h后對(duì)納米粒子的攝取效果,篩選超聲和/或微泡造影劑介導(dǎo)載Cy3-PDGF BB siRNA納米粒轉(zhuǎn)染RPE-J細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。RT-PCR法檢測(cè)最佳轉(zhuǎn)染條件處理后第1,2,4,6,8天RPE-J細(xì)胞內(nèi)PDGF BB mRNA的變化。MTT法檢測(cè)不同條件下轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染12 h后,熒光顯

15、微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)低強(qiáng)度超聲或者15-20％微泡可以安全有效增強(qiáng)低濃度載Cy3-siRNAmPEG-PLGA-PLL納米粒轉(zhuǎn)染RPE-J細(xì)胞,然而,在超聲及微泡最優(yōu)的轉(zhuǎn)染條件下,兩者聯(lián)合應(yīng)用沒有進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)納米粒子的攝取(P=0.072;P=0.488)。在最優(yōu)的超聲增強(qiáng)納米粒子遞送條件下,超聲和載Cy3-PDGF BB siRNA mPEG-PLGA-PLL納米粒聯(lián)合應(yīng)用明顯降低了RPE-J細(xì)胞內(nèi)PDGF BB基因mRNA及

16、蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:低強(qiáng)度超聲或15-20％微泡可以安全有效的增強(qiáng)載Cy3-siRNA納米粒子遞送到RPE-J細(xì)胞,超聲輻照的物理方法與mPEG-PLGA-PLL納米粒載體聯(lián)合應(yīng)用可以更為有效的下調(diào)目的基因的表達(dá)。
　　第Ⅳ部分 UTMD促進(jìn)載Cy3-siRNA納米粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討UTMD物理方法促進(jìn)載Cy3-siRNA納米粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜的有效性和安全性。
　　方法:5

17、0只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組:單純對(duì)照組;NPs+NS;NPs+MBS;NPs+NS+US;NPs+MBs+US(UTMD)。對(duì)照組每只大鼠左眼注射0.9％氯化鈉溶液15μl:4個(gè)實(shí)驗(yàn)組每只大鼠左眼注射12μl載Cy3-siRNA納米粒和3μl NS或MBs的混合液,即玻璃體腔內(nèi)均注射15μl的轉(zhuǎn)染液。超聲輻照條件為:1MHz,PRF100 Hz,2 W/cm2,50％的脈沖波,輻照時(shí)間5 min。轉(zhuǎn)染24 h后,視網(wǎng)膜組織鋪片觀察

18、Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)、強(qiáng)度及分布范圍。流式細(xì)胞儀測(cè)定視網(wǎng)膜單細(xì)胞懸液Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。病理切片觀察視網(wǎng)膜組織有無(wú)損傷。
　　結(jié)果:視網(wǎng)膜組織鋪片及流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示UTMD組陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量及熒光強(qiáng)度均高于其它四組(P＜0.05);UTMD組的組織切片顯示細(xì)胞排列整齊,層次清晰,無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論:UTMD技術(shù)在體內(nèi)能安全有效地促進(jìn)載Cy3-siRNAmPEG-PLGA-P