強(qiáng)化表達(dá)VEGF的老年人骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景：
　　 腦血管病是嚴(yán)重危害人類健康的三大致死疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，給家庭和社會(huì)帶來了極大的負(fù)擔(dān)。在腦血管疾病中，缺血性腦血管病占了80％左右。然而，迄今為止只有重組組織血纖維蛋白溶酶原激活物(rt-PA)一種藥物獲得了FDA的批準(zhǔn)用于急性腦缺血的治療。但rt-PA介入溶栓治療有嚴(yán)格的時(shí)間限制（必須在卒中發(fā)生6小時(shí)內(nèi)應(yīng)用），而且大劑量使用rt-PA也增加了發(fā)生腦出血的危險(xiǎn)性。因此

2、，如何促進(jìn)腦缺血后有效的組織和功能修復(fù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，但也是難點(diǎn)，而干細(xì)胞移植是近年來興起的具有良好的臨床應(yīng)用前途的治療腦缺血的新方法之一。
　　 BMSCs是源于骨髓的一種多潛能成體干細(xì)胞，其應(yīng)用于細(xì)胞治療的主要優(yōu)勢(shì)在于其可以自體移植，因而不存在胚胎干細(xì)胞移植所存在的免疫排斥、倫理學(xué)及致瘤性等方面的限制。而且骨髓源成體干細(xì)胞取材相對(duì)簡(jiǎn)單，不像神經(jīng)干細(xì)胞主要位于腦室下帶、海馬等腦深部結(jié)構(gòu)中，損傷風(fēng)險(xiǎn)性大、獲得困難、細(xì)胞來源有限

3、。BMSCs移植治療已經(jīng)應(yīng)用于腦缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)性治療。
　　 BMSCs移植治療腦缺血的方法較多，包括通過靜脈途徑、動(dòng)脈途徑或腦內(nèi)局部注射移植，用于BMSCs治療大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷模型(MCAO)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞能定向向缺血灶周圍遷徙，參與損傷修復(fù)，并促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。由于BMSCs具有分化成神經(jīng)細(xì)胞的能力，利用移植的BMSCs發(fā)揮細(xì)胞替代作用重建神經(jīng)環(huán)路是最直接的治療方法。然而，大部分的研究發(fā)現(xiàn)移植的BMSCs只

4、有相當(dāng)少的一部分表達(dá)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志，而即使這些少量的表達(dá)神經(jīng)組織標(biāo)志的細(xì)胞，目前也沒有電生理的或其他方面的證據(jù)顯示它們具有神經(jīng)細(xì)胞的功能，更無法確定它們是否同其他的神經(jīng)細(xì)胞建立了聯(lián)系。
　　 目前的研究顯示，BMSCs的起效機(jī)制是多方面的，如:減少缺血半影區(qū)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、促進(jìn)缺皿區(qū)新血管再生、抑制膠質(zhì)瘢痕增生以及促進(jìn)軸突再生等。歸結(jié)起來，BMSCs治療腦缺血的機(jī)制主要的并不是其替代了缺失的

5、神經(jīng)元，而是其在腦內(nèi)缺血的微環(huán)境的刺激下，發(fā)揮了“分子工廠”的作用，分泌各種營(yíng)養(yǎng)因子，介導(dǎo)了以上的治療作用。
　　 BMSCs在骨髓中的數(shù)量稀少，因此在應(yīng)用于細(xì)胞移植治療時(shí)必須進(jìn)行體外擴(kuò)增以獲得足夠多的細(xì)胞。然而，BMSCs同大多數(shù)的成體細(xì)胞一樣，會(huì)發(fā)生衰老，主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:①隨年齡增長(zhǎng)，BMSCs的數(shù)量和質(zhì)量均有明顯下降，而老年人正是腦缺血的高發(fā)人群，是可能的需要細(xì)胞移植治療的主體;②BMSCs在體外傳代過程中，細(xì)胞形態(tài)會(huì)

6、逐漸發(fā)生變化，由細(xì)梭形變成寬扁平狀，細(xì)胞的增殖能力、分化潛力、乃至向病灶區(qū)歸巢的能力均會(huì)逐漸喪失。因此，如果沒有采取特殊的處理方法對(duì)BMSCs進(jìn)行改造，只是在體外充分?jǐn)U增BMSCs再回輸回病人體內(nèi)，實(shí)際上已經(jīng)大大縮短了BMSCs的壽命，也嚴(yán)重影響了治療的效果。
　　 既往對(duì)BMSCs發(fā)生衰老的機(jī)制研究表明，BMSCs不表達(dá)端粒酶是一個(gè)很重要的原因。因此為了延長(zhǎng)BMSC的壽命甚至使之永生化，近幾年來，有多家實(shí)驗(yàn)室采用的是hTERT

7、基因轉(zhuǎn)染的方法，并成功獲得BMSCs永生細(xì)胞系。此法建立的細(xì)胞系在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)擴(kuò)增中端粒長(zhǎng)度沒有明顯縮短，保持了同原代BMSCs相似甚至更好的增殖及多向分化潛能。更為重要的是，用hTERT轉(zhuǎn)染建立的BMSCs細(xì)胞系在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)后仍保持了正常的染色體組型，細(xì)胞的生長(zhǎng)存在接觸抑制，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均沒有明顯的致瘤性。這是我們選擇hTERT作為修飾改造BMSCs的基因之一的原因。
　　 此外，通過神經(jīng)干細(xì)胞移植或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子來促進(jìn)受損

8、的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復(fù)是腦缺血治療的有效策略，但我們注意到，在缺血缺氧的微環(huán)境中，干細(xì)胞的成活十分困難，增殖和分化能力明顯減弱，難于發(fā)揮治療作用。血供的恢復(fù)是神經(jīng)修復(fù)的基礎(chǔ)，而VEGF是已知的胚胎發(fā)育期血管發(fā)生及成體后血管再生的最關(guān)鍵因子，VEGF對(duì)于腦缺血的治療作用已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，因此我們又選定了VEGF作為改造BMSCs的另一個(gè)基因。
　　 既往對(duì)于老年的BMSCs的研究較少，對(duì)其進(jìn)行雙基因改造的研究更是乏見，近年有研究表明，V

9、EGF和hTERT兩者之間有難得的協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)，這也是對(duì)我們這一探索性研究意義的一個(gè)側(cè)面的肯定。
　　 二.研究目的：
　　 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)移植是治療腦缺血的一個(gè)有效策略，然而，BMSCs隨年齡增長(zhǎng)以及在體外擴(kuò)增過程中會(huì)發(fā)生衰老，這阻礙了它的治療應(yīng)用。本研究擬以人端粒酶催化亞單位（hTERT）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)慢病毒表達(dá)載體雙基因聯(lián)合修飾老年人的BMSCs，探索構(gòu)建強(qiáng)化表達(dá)VEGF的永生化BM

10、SCs系，檢測(cè)其生物學(xué)特征，并以改造后的BMSCs治療大鼠腦缺血/再灌注模型，檢測(cè)治療效果，探討治療機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)過程中，與未經(jīng)修飾的BMSCs及hTERT或VEGF單基因修飾的BMSCs進(jìn)行對(duì)比研究。由于BMSCs含有自體的遺傳信息，研究成果將有助于探索制備個(gè)體化的(patient-specific)、針對(duì)腦缺血治療的(disease-specific)干細(xì)胞產(chǎn)品，也會(huì)為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 三.材料和方法

11、r>　　 1、老年人骨髓基質(zhì)細(xì)胞hBMSC的分離、培養(yǎng)與鑒定:采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的全血細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的方法，取正常成年人骨髓，年齡在50歲以上，1∶1～1∶2加入含有20％ FBS血清的DMEM low glucose培養(yǎng)基（含1％雙抗），48小時(shí)后半量換液，小心去除上層懸浮紅細(xì)胞，勿晃動(dòng)下層貼壁細(xì)胞，隨后繼續(xù)培養(yǎng)。72小時(shí)候再次半量換液，并于倒置顯微鏡下觀察，可見貼壁細(xì)胞，隨后3～4天正常全量換液，去除多余的不貼壁細(xì)胞，一般15天左右

12、可長(zhǎng)滿，為原代hBMSCs。隨后用0.05％的胰酶消化，1∶2傳代，多次傳代后去除可能的成纖維細(xì)胞。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組:將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為以下5組:①未轉(zhuǎn)染組(hBMSC);②空病毒組(vehicle)③VEGF轉(zhuǎn)染組(hBMSC-VEGF)，應(yīng)用慢病毒載體攜帶VEGF165基因以最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=5體外轉(zhuǎn)染hBMSCs;④TERT轉(zhuǎn)染組(hBMSC-TERT):應(yīng)用慢病毒

13、載體攜帶hTERT基因以感染復(fù)數(shù)MOI=5體外轉(zhuǎn)染hBMSCs;⑤雙病毒轉(zhuǎn)染組(hBMSC-V&T):慢病毒載體攜帶VEGF和hTERT依次以感染復(fù)數(shù)MOI=5體外轉(zhuǎn)染hBMSCs。
　　 3、細(xì)胞表型特征:流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞表面標(biāo)志。
　　 4、體外管狀結(jié)構(gòu)形成:檢測(cè)細(xì)胞接種在Matrigel Matrix（基底膜基質(zhì)）上，觀察細(xì)胞形成毛細(xì)胞血管狀結(jié)構(gòu)的能力。
　　 5、裸鼠體內(nèi)成血管能力測(cè)試:將各組細(xì)胞移

14、植入裸鼠皮下三周后檢測(cè)其在裸鼠體內(nèi)形成血管的能力。
　　 6、移植細(xì)胞治療短暫腦缺血模型(tMCAO)大鼠，對(duì)其有效性做行為學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及蛋白學(xué)等多水平的觀察檢測(cè)，并試圖揭示其可能的機(jī)制。
　　 7、對(duì)細(xì)胞移植的模型鼠行CatWalk行為學(xué)綜合評(píng)價(jià)，以期找到最適合的指標(biāo)，并評(píng)價(jià)治療的效果。
　　 8、取移植細(xì)胞的模型大鼠腦組織，研究移植細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸及其對(duì)缺血大腦分泌細(xì)胞因子的影響。
　　 9、

15、所有原始數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((X)±SE)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。造模后各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)比較用重復(fù)測(cè)量的方差分析，單個(gè)時(shí)間點(diǎn)間數(shù)據(jù)比較用one-way ANOVA分析，組間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)法，如果數(shù)據(jù)方差不齊，則采用welch法進(jìn)行多組均數(shù)的比較，組間多重比較采用Tamhane's T2法;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四.結(jié)果
　　 1、本課題組前期實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證慢病毒對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

16、是成功有效的，細(xì)胞的壽命得到顯著延長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)端粒酶和VEGF的表達(dá)顯著增加，并沒有明顯的致瘤性。
　　 2、在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，VEGF和hTERT的轉(zhuǎn)染能顯著增強(qiáng)hBMSCs的體外成血管能力。
　　 3、免疫熒光結(jié)果顯示Dil標(biāo)記的移植細(xì)胞增加了裸鼠體內(nèi)表達(dá)vWF的血管狀結(jié)構(gòu)的形成，并整合進(jìn)了這種新生的血管樣結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，VEGF或\和TERT的轉(zhuǎn)染能顯著提高h(yuǎn)BMSC移植后在裸鼠體內(nèi)形

17、成血管樣結(jié)構(gòu)的密度和周長(zhǎng)。
　　 4、大鼠移植hBMSC后，神經(jīng)功能評(píng)分皆有好轉(zhuǎn)，移植組與對(duì)照組的差異早期并不是非常顯著，但到第7天開始在hBMSC-V(6.5±0.18)和hBMSC-V&T(6.9±0.24)組與對(duì)照組(7.6±0.26)見可見顯著性差異，并在隨后的14天和28天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)移植細(xì)胞干預(yù)的三組與對(duì)照組均出現(xiàn)了顯著性的差異。
　　 5、TTC染色結(jié)果表明，hBMSC的移植對(duì)大鼠的梗死區(qū)域有減小作用，而其中

18、hBMSC-V&T和hBMSC-V組的效果最明顯。
　　 6、對(duì)大鼠缺血損傷側(cè)的左前肢壓強(qiáng)結(jié)果分析，各組大鼠28天的左前肢壓強(qiáng)有一定程度的恢復(fù)，但是在各組間比較，移植hBMSC-V，hBMSC-T和hBMSC-V&T細(xì)胞的三組大鼠左前肢壓強(qiáng)恢復(fù)更顯著，與對(duì)照組比較有顯著性差異，并且V&T組恢復(fù)的程度最大。
　　 7、對(duì)各組大鼠缺血28天后大鼠的四肢最大接觸面積結(jié)果分析，移植BMSC-V，hBMSC-T和hBMSC-V&T

19、細(xì)胞的三組大鼠四肢最大接觸面積較僅移植hBMSC的對(duì)照組有顯著增大。
　　 8、模型組大鼠運(yùn)動(dòng)速度在造模后第1、3、7、14、28天均比對(duì)照組明顯減慢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而步調(diào)改變?yōu)橐贿^性，模型組大鼠造模后第1、3、7天與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，第14、28天與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 9、MRI成像結(jié)果基本同TTC染色結(jié)果較一致，各組間存在差異，28天時(shí)h

20、BMSC-V&T組的腦梗死灶最小，恢復(fù)的程度最大，為153.5±8.45mm3，hBMSC-V組為174.6±6.80 mm3，hBMSC-T組為183.1±10.17 mm3，而hBMSC對(duì)照組為242.3±9.85 mm3。
　　 10、模型鼠腦組織切片顯示移植細(xì)胞主要分布在缺血半影區(qū)，沿缺血灶周邊分布，觀察終點(diǎn)時(shí)仍有較強(qiáng)的熒光表達(dá)。
　　 11、基因檢測(cè)結(jié)果表明，模型鼠腦組織的VEGF(人和大鼠)、hTERT(人)

21、、突觸素P38表達(dá)均增加，CD31染色表明細(xì)胞整合進(jìn)新生的血管，且較對(duì)照組血管數(shù)目和密度都有增加。
　　 五.結(jié)論
　　 1、hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，建立強(qiáng)化表達(dá)VEGF的BMSCs細(xì)胞系是可行的，安全有效的，具有重要的臨床價(jià)值。
　　 2、大鼠短暫腦缺血模型驗(yàn)證聯(lián)合修飾的細(xì)胞對(duì)大鼠的治療效果顯著，神經(jīng)功能恢復(fù)較對(duì)照組有明顯改善。
　　 3、強(qiáng)化表達(dá)VEG