十二種疾病特異的iPS系和血小板無力iPS疾病模型的建立以及hESCs胞質(zhì)中重編程相關(guān)因子的檢測.pdf

1、疾病材料的獲得對人類疾病的研究是十分重要的。人類疾病的發(fā)生發(fā)展十分復(fù)雜，以人本身作為實驗和研究對象來深入探討疾病發(fā)生機制以及致病機理，對醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的推動是十分緩慢的，而且許多涉及人體的實驗在道義上和方法上也受到限制。而疾病的動物模型由于種屬差異、解剖和生理的不同，很多先天或獲得性疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型不能真實的反映人類疾病的病理生理學(xué)。
　　 誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS

2、Cs）的出現(xiàn)使獲得病人特異性的多能性干細(xì)胞成為可能。由于iPSCs類似于胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有多能性，而且可以避免限制胚胎干細(xì)胞臨床治療的組織相容性問題，對于多種疾病，病人特異的iPSCs作為無限的細(xì)胞來源不僅在建立疾病模型而且在藥物篩選和細(xì)胞替代治療上都具有巨大的潛力。
　　 本研究利用iPS技術(shù)建立了十二種遺傳性疾病特異的誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞系，其中9種疾病的iPS系國際上尚無報道

3、，并以血小板無力為例探討了疾病的iPS模型建立的可行性，為進(jìn)一步的疾病機制研究和疾病治療奠定基礎(chǔ)。同時為了避免慢病毒感染方法所帶來的安全性問題以及外源DNA的參與，本研究探討了利用人胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)重編程體細(xì)胞的可行性，對人胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)可以重編程體細(xì)胞給出了直接證據(jù)，1為獲得無外源DNA參與的病人特異的多能性細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。本研究分兩個部分，主要研究方法及結(jié)果如下:
　　 第一章十二種疾病特異的iPS系和血小板無力iPS疾病模型

4、的建立
　　 第一節(jié)十二種疾病特異的iPS系的建立
　　 目的:1、利用慢病毒感染方法建立人成纖維細(xì)胞來源的誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞，并與hESCs比較其分化能力;2、建立多種疾病的iPSCs細(xì)胞系;
　　 方法:1、采用慢病毒感染的方法將Oct4/Sox2/Nanog/Lin28四種因子導(dǎo)入成纖維細(xì)胞獲得誘導(dǎo)性多能性細(xì)胞(iPSCs)，對建立的iPSCs進(jìn)行全面細(xì)致的鑒定，并且與本實驗室分離得到的hESCs對分化過程

5、中三胚層分化基因以及全能性基因的表達(dá)進(jìn)行比較;2、收集多種遺傳病病人皮膚的成纖維細(xì)胞，利用慢病毒感染方法建立多種疾病的iPSCs細(xì)胞系，并進(jìn)行初步鑒定;
　　 結(jié)果:1、利用慢病毒感染的方法有效建立了人流產(chǎn)胚胎皮膚成纖維細(xì)胞來源的iPSCs系，獲得iPS細(xì)胞的效率為10-5～-4，在表面標(biāo)記，EB分化等方面獲得的iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞相似，并經(jīng)STR分析證實iPS確實來源于人胚胎成纖維細(xì)胞而非胚胎干細(xì)胞的污染;2、利用iPS技術(shù)

6、建立了12種遺傳病病人特異的iPSCs系，這些細(xì)胞系均具有胚胎干細(xì)胞的典型特征，其中所檢測的細(xì)胞系均含有與其來源病人相同的基因突變或染色體改變。
　　 結(jié)論:利用慢病毒感染的方法能有效的建立來自12種疾病病人的iPSCs系，其中9種疾病iPSCs國際上尚無相關(guān)報道，為進(jìn)一步的疾病機制和疾病治療的研究提供了材料。
　　 第二節(jié)血小板無力iPS疾病模型的建立及初步研究
　　 目的:建立血小板無力(Glanzmann

7、thrombasthenia，GT)患者特異的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系，并將其向血小板方向誘導(dǎo)分化，探討血小板無力的iPSCs能否作為疾病模型有效的體外重現(xiàn)血小板無力的發(fā)生獲得具有疾病表型的血小板。
　　 方法:利用慢病毒感染的方法將血小板無力患者皮膚活檢得到的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)得到血小板無力iPSCs(GT-iPSCs)，并對其進(jìn)行干細(xì)胞特性鑒定。同時利用基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)GT-iPSCs和hESCs向血小板方向誘導(dǎo)分化，并對得到

8、的血小板進(jìn)行表型檢測和聚集功能分析，并利用病毒感染的方法進(jìn)行初步的基因糾正。
　　 結(jié)果:從血小板無力患者的皮膚成纖維細(xì)胞建立了血小板無力iPSCs系，獲得的GT-iPSCs具有胚胎干細(xì)胞的典型特征。體外可以向三胚層分化，通過與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)可獲得血小板，與hESCs相比，誘導(dǎo)效率較低，獲得的血小板無CD41a與CD61的表達(dá)，ADP刺激不能發(fā)生活化和聚集。經(jīng)過基因修正后由GT-iPS得到的血小板樣的顆粒表達(dá)CD41a

9、并且能夠參與微聚體的形成。
　　 結(jié)論:首次利用慢病毒感染方法獲得了血小板無力的iPSCs，并能有效的體外重現(xiàn)疾病的發(fā)生，可作為進(jìn)一步研究疾病機制和治療的疾病模型。將正常的CD41基因轉(zhuǎn)入GT-iPS細(xì)胞可以恢復(fù)血小板正常的聚集功能，說明在細(xì)胞水平上基因治療是有效的，為今后的基因治療開拓了一條新路。
　　 第二章阻滯于有絲分裂中期（M期）的胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)中體細(xì)胞重編程相關(guān)因子的檢測
　　 目的:檢測從有絲分裂中期

10、（M期）的人胚胎干細(xì)胞分離獲得的胞質(zhì)是否含有重編程體細(xì)胞必要的重編程因子如OCT4，NANOG等，從而為分裂中期的人胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)具備重編程體細(xì)胞為病人特異的全能性細(xì)胞的能力提供依據(jù)。
　　 方法:檢測了人胚胎干細(xì)胞中多能性相關(guān)因子OCT4/SOX2/NANOG在分裂期以及分裂間期細(xì)胞內(nèi)的定位，并將人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行同步化后使用密度梯度離心法分離處于M期的胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行全能性相關(guān)因子的檢測。
　　 結(jié)果:處于M期

11、的人類胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)含有OCT4、 NANOG和SOX2等重編程相關(guān)因子;聯(lián)合應(yīng)用胸腺嘧啶和TN-16可使48.83％±7.99％的hESCs同步于M期;通過密度梯度離心可有效的去除hES的細(xì)胞核，獲得大量含有重編程因子的hES胞質(zhì)。
　　 結(jié)論:本研究首次直接證實了阻滯于有絲分裂中期（M期）的人胚胎干細(xì)胞的胞質(zhì)包含有重編程相關(guān)的因子，并可通過密度梯度離心的方法獲得。對人類胚胎干細(xì)胞胞質(zhì)可以重編程體細(xì)胞給出了直接證據(jù)，為獲得無外