免疫性血小板減少癥動物模型的建立及相關(guān)調(diào)節(jié)基因在模型中的動態(tài)分析.pdf

1、免疫性血小板減少性紫癜（ITP）是一種器官特異性的自身免疫性疾病，主要癥狀是體內(nèi)的血小板被機體自身產(chǎn)生的抗血小板抗體破壞，同時血小板的生成也受到了抑制。此病在臨床上主要表現(xiàn)為皮膚與粘膜的淤血、受到創(chuàng)傷后血流不止、嚴重的還會導致顱內(nèi)出血。ITP確切致病機理至今尚未明了。由于致病機理不明，臨床上尚無有效而沒有毒副作用的治療方法，很多病人不得不切除脾臟以維持生命，生活質(zhì)量受到嚴重損害。實際上，雖然人類及哺乳動物血小板數(shù)量的平衡對于阻止微小傷口

2、的出血及免疫方面有很重要的功能，但是調(diào)節(jié)血小板數(shù)量的確切分子機制仍然還不清楚。 不僅治療ITP存在一定的難度，甚至研究ITP治療方法本身由于某些原因也非常復雜。利用動物模型來研究ITP的治療方法及發(fā)病機理將會使問題變得簡單一些，目前已經(jīng)建立了一些血小板減少性紫癜的動物模型，包括以免疫機制介導的ITP動物模型以及非免疫機制介導的ITP動物模型。但是到目前為止，仍然沒有一種理想的動物模型能夠完全模擬人類疾病發(fā)病的全部過程。

3、本項研究中，通過探索建立了兩種以免疫方式介導的ITP小鼠模型。首先利用免疫學中交叉反應原理建立了一個小鼠ITP疾病模型，分離Wistar大鼠的血小板，按照一定的免疫程序注射129/sv小鼠。注射大鼠血小板后，從第7天開始，小鼠的血小板開始下降，直到14天的時候，小鼠的血小板下降到了最低值。該模型（模型一）和人類ITP發(fā)病形式較為接近，它能反映出自身抗體產(chǎn)生的過程。在進一步摸索模型一最優(yōu)化試驗條件的同時，另外又利用豚鼠制造了豚鼠抗Balb

4、/c小鼠血小板抗體，然后將抗血小板抗體注射給Balb/c小鼠，制造出了更為有效的ITP小鼠模型（模型二）：當小鼠接受特定劑量的抗體注射后，小鼠血小板數(shù)量在4h就下降到幾乎檢測不到的狀態(tài)，在最低狀態(tài)時保持了44h，在注射抗體72h后血小板開始回升，并且在注射抗體144h后血小板的數(shù)量達到了最高點，在經(jīng)過了第二次血小板數(shù)量波動后，最后在408h的時候達到平衡。該項結(jié)果表明，至少在小鼠中，血小板在受到損害后機體能夠立即啟動補償機制來加速血小板

5、生成，直到其數(shù)量達到保護機體防止出血的水平。由于血小板的生成涉及骨髓造血干細胞的生成和一系列的細胞分化過程，包括巨核細胞條件分化調(diào)節(jié)，這是一個極為重要和復雜的血液生物學過程。本研究建立的是高度可重復的血小板人為降低的小鼠模型，這種模型使血小板數(shù)量下降的程度很明顯。 利用建立的小鼠ITP模型二平臺，選擇了一組已有證據(jù)證明參與血小板生成調(diào)節(jié)的基因，同時觀察其在血小板生產(chǎn)過程中基因的動態(tài)表達變化。本研究中采用半定量RT-PCR的方法，

6、檢測了CD41、c-myb、c-mpl、caspase-3、caspase-9、GATA-1和Bcl-xl這些基因在血小板數(shù)量波動的7個不同時期的脾臟和骨髓中mRNA表達。同時采用Western blot和免疫組織化學的方法檢測了這些基因在骨髓和脾臟中蛋白表達的變化，力圖找到除了血小板生成素（thrombopoietin，簡稱TPO）以外的保持血小板數(shù)量平衡的因子。TPO在本研究中沒有檢測，因為預實驗發(fā)現(xiàn)該基因的mRNA表達產(chǎn)物主要在肝

7、臟表達，在骨髓和脾臟組織中檢測不到。重復多次的實驗結(jié)果表明，上述7個基因的mRNA水平的變化和血小板數(shù)量變化有非常明顯的相關(guān)性，其中所有上述7個基因的mRNA在骨髓組織中的表達譜與在脾臟中的完全相反：在144h的時候，也就是當外周血中血小板數(shù)量最多的時候，骨髓中這7個基因的轉(zhuǎn)錄本都沒有檢測到。同樣在這個時間，除了CD41，脾臟中這些基因的表達反而是升高的。Western blot的試驗表明骨髓中caspase-3、GATA-1的蛋白變化

8、與mRNA的表達變化是一致的，都是在外周血小板數(shù)量最多的時候，骨髓中的蛋白表達下調(diào)到最低的程度。在外周血小板數(shù)量不同的時間骨髓中c-myb蛋白的表達沒有很明顯的變化。免疫組化的結(jié)果表明免疫后144h脾臟中GATA-1、caspase-3、caspase-9、Bcl-xl這些蛋白在外周血小板數(shù)量最多的時候表達量都是升高的，而c-myb、c-mpl、CD41這些蛋白在免疫后144h的表達量與正常相比沒有明顯變化。因為骨髓是血小板生成的部位，

9、而脾臟是血小板被破壞的部位。當血小板最多的時候，骨髓中的基因下調(diào)表達來抑制血小板的生成，而脾臟中的基因上調(diào)發(fā)揮作用來使多余的血小板被降解掉。據(jù)此初步認為caspase-3、GATA-1是與血小板的生成有關(guān)，而caspase-3、caspase-9、GATA-1、Bcl-xl與血小板的降解有關(guān)。綜上所述，caspase-3、GATA-1與維持血小板在一個穩(wěn)定狀態(tài)有關(guān)。當然這些初步結(jié)果還需要近一步的試驗來驗證。 本試驗建立的ITP小