Beclin1、lin28b在結(jié)直腸腺瘤中的表達.pdf

1、目的:目前研究表明結(jié)直腸癌的發(fā)病率以及死亡率正日益增長，結(jié)直腸癌是消化道腫瘤中較常見的一種，在全球男性最常見癌癥中排第三位，女性中排第二位，2012年估計有136萬新增病例[1]，它也是世界第四大最常見的癌癥死亡原因(2008和2012)，占所有癌癥死亡人數(shù)的8.5％，并且每年死亡數(shù)接近69萬人[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機制目前尚未明確，一般認為大部分的結(jié)直腸癌是來源于結(jié)直腸腺瘤，其中結(jié)直腸腺瘤可分為管狀腺瘤、混合性腺瘤、絨毛狀腺瘤，加強對

2、結(jié)直腸腺瘤認識，對預防結(jié)直腸癌起到至關(guān)重要的作用。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，結(jié)直腸粘膜上皮細胞癌變是多步驟、多階段及多基因參與的過程。此過程不僅涉及細胞過度增殖，并且與細胞凋亡有著密切的聯(lián)系。
　　Beclin1與酵母自噬基因ATg6/Vps30是同源基因，1998年，Liang等[2]在對Sinbis病毒感染的致死性病毒性腦炎中發(fā)現(xiàn)一種新的60kDa的卷曲蛋白質(zhì)，可以與bcl-2的基因產(chǎn)物bcl-2相互作用，它們將其命

3、名為Beclin1，它位于人類染色體17q21并且可以編碼與凋亡控制蛋白bcl-2相互作用的蛋白。它是自噬過程中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。此外，Beclin1與許多生物學途徑密切相關(guān)，包括對壓力的適應，發(fā)育，胞吞，胞質(zhì)分裂，免疫，腫瘤的發(fā)生，老化及細胞凋亡。它的功能在多種機制中被檢測出，比如表觀遺傳沉默，microRNA的調(diào)控，翻譯后修飾，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等。多種疾病與Beclin1的缺乏及功能異常有關(guān)，這使它成為各種治療方法的一個潛在的有

4、價值的靶向，包括抗癌治療。已有相關(guān)研究證實Beclin1在腫瘤的生長中起到重要作用，但是機制仍不能明確，有的研究認為它是通過誘導腫瘤細胞的自噬性死亡或者凋亡來抑制腫瘤細胞的增殖，或是通過預防腫瘤炎癥反應及壞死反應而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌以及前列腺癌中表達下調(diào)，并在這些癌癥組織中存在基因的缺失性突變。但在結(jié)腸癌中Beclin1高表達，其在結(jié)腸癌組織中異常高表達的作用機制仍不十分明確。
　　Lin28是一種

5、RNA結(jié)合蛋白。Lin28b與Lin28是同源基因，Lin28與KLF4、SOX2、NANOG共同在體細胞中表達時，可以將體細胞逆轉(zhuǎn)成多功能干細胞。Lin28和Lin28b都含有冷休克結(jié)構(gòu)域(cold shock domain，CSD)和一對反向的CCHC鋅指模體，這些結(jié)構(gòu)使得它能與RNA結(jié)合。Lin28阻斷l(xiāng)e-t7家族miRNA的加工處理，Lin28/let-7參與多種生物功能，包括腫瘤的發(fā)生，Lin28b通過阻斷l(xiāng)et-7通路促進

6、腫瘤的發(fā)生，激活Lin28b的表達還可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。
　　本實驗旨在通過對結(jié)直腸癌、結(jié)直腸管狀腺瘤、混合性腺瘤、絨毛狀腺瘤及正常結(jié)直腸粘膜中Beclin1及Lin28b的表達情況的研究，探討其在結(jié)直腸腺瘤發(fā)展過程中的作用及意義，以期為結(jié)直腸腫瘤的早期診斷及治療提供有利的理論依據(jù)。
　　方法:收集2012年1月至2014年8月解放軍252醫(yī)院經(jīng)外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌100例及配對正常結(jié)直腸粘膜組織60例(亦稱為癌旁組織

7、，取自手術(shù)切除殘端，距離癌組織至少5cm)，100例結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未接受化療、放療及靶向治療。消化內(nèi)鏡中心獲取100例結(jié)直腸腺瘤組織，其中包括結(jié)直腸管狀腺瘤30例，混合性結(jié)直腸腺瘤35例，絨毛狀結(jié)直腸腺瘤35例（所有組織均由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師審查及篩選）。將每次獲得的部分新鮮組織放入RNA保存液中后置于-20℃的冰箱中，用于進行熒光定量PCR，另一部分放于10％的甲醛中固定、石蠟包埋、常規(guī)連續(xù)切片，然后進行免疫組織化學染色。

8、>　　1、HE染色用于區(qū)分目標組織的病理類型和分化程度。
　　2、應用免疫組織化學的方法檢測Beclin1及Lin28b的表達產(chǎn)物在細胞中的定位及表達的強度。
　　3、利用熒光定量PCR的方法檢測Beclin1mRNA及Lin28bmRNA在組織中表達量。
　　統(tǒng)計學方法:應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件的卡方檢驗及單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1免疫組織化

9、學檢測結(jié)果:Beclin1和Lin28b染色的陽性物質(zhì)為棕黃色，均表達于胞質(zhì)中。在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸正常組織中Beclin1的陽性表達率分別為85％、73％、35％，三者之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在結(jié)直腸管狀腺瘤、結(jié)直腸混合性腺瘤、結(jié)直腸絨毛狀腺瘤中陽性表達率分別為43.3％、60％、82.9％，統(tǒng)計學分析結(jié)果在不同類型的結(jié)直腸腺瘤中Beclin1的表達情況的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Beclin

10、1的表達與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、Dukes分期有關(guān)(P＜0.05)，而與年齡及性別無關(guān)(P＞0.05)。在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸腺瘤組織、結(jié)直腸正常組織中Lin28b的陽性表達率分別為80％、65％、30％，三者有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在結(jié)直腸管狀腺瘤、結(jié)直腸混合性腺瘤、結(jié)直腸絨毛狀腺瘤中陽性表達率分別為33.3％、65.7％、77.1％，統(tǒng)計學分析結(jié)果在不同類型的結(jié)直腸腺瘤中Lin28b的表達情況的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05

11、)，Lin28b的表達與淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、Dukes分期有關(guān)(P＜0.05)，而與年齡及性別無關(guān)(P＞0.05)。
　　2熒光定量PCR檢測結(jié)果:應用半定量的TaqMan PCR對所留取的結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸絨毛狀腺瘤、結(jié)直腸混合性腺瘤、結(jié)直腸管狀腺瘤、結(jié)直腸正常粘膜進行檢測，Beclin1 mRNA在組織中的表達量分別為8.196±0.760、5.680±1.178、3.898±0.520、3.566±0.625、0.31

12、2±0.419，在上述組織中的表達量依次降低，F(xiàn)=75.11074，P＜0.05。SNK多重比較結(jié)果顯示任兩組間總體均數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義，Lin28b mRNA在結(jié)直腸癌組織、結(jié)直腸絨毛狀腺瘤、結(jié)直腸混合性腺瘤、結(jié)直腸管狀腺瘤、結(jié)直腸正常粘膜組織中的表達量分別為17.994±2.044、11.080±0.947、7.232±1.580、3.966±0.833、1.656±0.740，在上述組織中的表達量依次降低，F(xiàn)=117.5025，