脂肪來源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、涎腺的放射損傷常使其功能低下甚至喪失，引發(fā)一系列功能障礙。對于涎腺放射損傷，傳統(tǒng)的治療手段治療效果有限，不能從根本上解決問題。近年來，干細(xì)胞的研究逐漸深入，許多疾病的治療在未來成為可能，其中骨髓干細(xì)胞和脂肪來源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）在涎腺放射損傷中起到一定的改善功能的效果。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs復(fù)合富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）可以在一定程度

2、上改善放射損傷后涎腺的功能，并且較單純的ADSCs治療效果更好。但相關(guān)的作用機(jī)制尚不清楚，我們根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，推測ADSCs之所以能修復(fù)涎腺放射損傷是因為其向涎腺腺泡樣細(xì)胞（salivary gland acinar-like cells，SGALCs）轉(zhuǎn)分化，并且PRF起到促進(jìn)轉(zhuǎn)分化的作用。因此本實驗研究以體外涎腺細(xì)胞（salivary gland cells，SGCs）和ADSCs共培養(yǎng)，并施加PRF干預(yù)，驗證我們的猜想。

3、　　目的：
　　探討ADSCs向SGALCs轉(zhuǎn)分化的可能性，并探究PRF在轉(zhuǎn)分化中的作用，為ADSCs復(fù)合PRF治療涎腺放射損傷提供理論依據(jù)，同時為涎腺組織工程再生提供一種更合適的種子細(xì)胞。
　　方法：
　　1.無菌切取C3H小鼠下頜下腺，分離培養(yǎng)下頜下腺細(xì)胞，觀察活細(xì)胞形態(tài)，HE染色細(xì)胞形態(tài)及透射電鏡下腺泡細(xì)胞特有的酶原顆粒，并通過細(xì)胞角蛋白8（cytokeratin8，CK8）及波形蛋白（vimentin）免疫熒光

4、染色，α-淀粉酶免疫熒光染色及 Western Blot從蛋白水平，通過 CK8、vimentin、α-淀粉酶及水通道蛋白5（aquaporin-5，AQP-5）的mRNA RT-PCR檢測從基因水平鑒定細(xì)胞來源。
　　2.無菌切取C3H小鼠腹股溝脂肪帶，分離培養(yǎng)ADSCs，觀察活細(xì)胞形態(tài)，HE染色細(xì)胞形態(tài)，MTT測定細(xì)胞生長曲線，流式檢測干細(xì)胞表面分子，成脂及成骨鑒定細(xì)胞干性。
　　3.抽取兔耳中動脈血，離心制備PRF，將

5、獲得的PRF凝膠凍干并研磨成顆粒，按25mg PRF顆粒/1ml無血清培養(yǎng)基的比例制備PRF浸提液，用ELISA檢測其體外釋放血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子-BB（platelet-derived growth factor BB，PFGF-BB）的特點，并研究其對ADSCs增殖，遷移和骨向分化的影響。
　　4.利用孔徑為0.4μm的Trans

6、well小室放置于孔板中建立共培養(yǎng)系統(tǒng)，實驗組將獲得的下頜下腺細(xì)胞培養(yǎng)在上層小室內(nèi)，ADSCs培養(yǎng)在下層孔板中。對照組上層小室內(nèi)不含有下頜下腺細(xì)胞。在培養(yǎng)7天，14天和21天后，分別取對應(yīng)的實驗組和對照組，觀察ADSCs的形態(tài)，通過α-淀粉酶,CK8及vimentin免疫熒光染色鑒定轉(zhuǎn)分化情況；通過α-淀粉酶免疫熒光染色計數(shù)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞，計算轉(zhuǎn)分化率；最后通過α-淀粉酶Western Blot及CK8，AQP-5，vimentin和

7、α-淀粉酶 mRNA RT-PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)分化情況。
　　5.在ADSCs成骨誘導(dǎo)體系中加入不同濃度的PRF浸提液（0.5％，1%，3%，5%，7%，10%），誘導(dǎo)7天后檢測成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），Ⅰ型膠原（collagenⅠ，COLⅠ），runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor2，RUNX2）及骨鈣蛋白（osteocalci

8、n，OCN）的表達(dá)，并于21天行茜素紅染色。此外，以共培養(yǎng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，添加不同濃度的PRF浸提液（0.5%，1%和5%），共培養(yǎng)7天后，正常共培養(yǎng)組與不同濃度PRF浸提液組分別進(jìn)行α-淀粉酶免疫熒光染色，計數(shù)陽性細(xì)胞，計算脂肪來源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化率，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。同時對不同濃度 PRF浸提液組進(jìn)行α-淀粉酶 Western Blot及 CK8，AQP-5，vimentin和α-淀粉酶mRNA RT-PCR分

9、析。
　　結(jié)果：
　　1.成功培養(yǎng)具有良好功能的涎腺細(xì)胞：
　　體外分離培養(yǎng)的小鼠下頜下腺細(xì)胞呈多邊形或卵圓形，密集排列時呈鋪路石樣；HE染色胞漿呈紅色，胞核呈藍(lán)色，基本位于細(xì)胞中央；透射電鏡觀察到胞漿內(nèi)存在黑色致密的顆粒，即為酶原顆粒；免疫熒光染色α-淀粉酶及CK8呈陽性，波形蛋白呈陰性；α-淀粉酶Western Blot顯示約53kDa處呈現(xiàn)特異性條帶；RT-PCR結(jié)果顯示下頜下腺細(xì)胞表達(dá)CK8、α-淀粉酶及AQP

10、-5，不表達(dá)波形蛋白。
　　2.成功培養(yǎng)功能良好的脂肪來源干細(xì)胞：
　　體外分離培養(yǎng)的小鼠ADSCs呈長梭形，有胞突，密集排列時呈魚群樣。HE染色胞漿呈紅色，胞核成藍(lán)色。其生長曲線大致呈“S”型，與其他干細(xì)胞生長特點相似。ADSCs陽性表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，并具備成脂成骨分化能力。
　　3.富血小板纖維蛋白能持續(xù)釋放生長因子且一定劑量內(nèi)能促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的增殖和遷移：
　　由兔耳中動脈血離心制備的 PRF凝膠凍

11、干后，可研磨成顆粒狀，其能持續(xù)釋放VEGF和PDGF-BB。不同濃度的PRF浸提液對ADSCs的生物學(xué)行為影響不同，其中以1%PRF浸提液組對ADSCs增殖和成骨分化具有較明顯的促進(jìn)作用，以50%PRF浸提液組對ADSCs的遷移具有較明顯促進(jìn)作用。
　　4.脂肪來源干細(xì)胞能轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞：
　　下頜下腺細(xì)胞誘導(dǎo)ADSCs發(fā)生轉(zhuǎn)分化，干細(xì)胞α-淀粉酶及CK8免疫熒光染色呈現(xiàn)陽性，第7天，14天，21天的轉(zhuǎn)分化率分別為：

12、22.87±1.66%；40.56±1.74%；49.84±1.93%。轉(zhuǎn)分化后干細(xì)胞α-淀粉酶Western Blot顯示，第7天，14天，21天樣本在53kDa處出現(xiàn)條帶，其灰度值依次增高。α-淀粉酶，AQP-5及CK8 mRNA RT-PCR分析結(jié)果顯示三者mRNA含量在第7天，14天，21天依次增加，Vimentin mRNA表達(dá)量依次降低。對照組干細(xì)胞未發(fā)生轉(zhuǎn)分化。
　　5.一定劑量的PRF能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化：

13、r>　　與正常成骨誘導(dǎo)相比，0.5%,1%,3%和5%PRF浸提液組的ALP，COLⅠ,RUNX2及OCN表達(dá)量較高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這四組中茜素紅染色可見更多的礦化結(jié)節(jié)。共培養(yǎng)系統(tǒng)中，0.5%PRF浸提液組,1%PRF浸提液組和5%PRF浸提液組的干細(xì)胞7天轉(zhuǎn)分化率分別為30.39±1.51%,36.20±1.33%,28.78±0.83%。與正常共培養(yǎng)組相比，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方差分析，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且不同濃度 PR

14、F浸提液組之間比較，以1%PRF浸提液組轉(zhuǎn)分化率最高，與其他組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。α-淀粉酶Western Blot及α-淀粉酶mRNA RT-PCR分析顯示，PRF浸提液組與正常組具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），不同濃度PRF浸提液組間比較，以1%PRF浸提液組表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.成功分離培養(yǎng)小鼠下頜下腺細(xì)胞，呈多邊形，具有較強(qiáng)增殖能力，胞內(nèi)含有特異性酶原顆粒，能

15、表達(dá)特異性的α-淀粉酶，為具備良好功能的涎腺細(xì)胞。
　　2.成功分離培養(yǎng)小鼠脂肪來源干細(xì)胞，長梭形，自我更新能力較強(qiáng)，干細(xì)胞表面標(biāo)志性CD分子呈陽性，具有成脂成骨的分化潛能，為性能優(yōu)良的干細(xì)胞。
　　3.富血小板纖維蛋白富含多種生長因子，在培養(yǎng)液中能穩(wěn)定且規(guī)律性的釋放血管內(nèi)皮生長因子和血小板衍生生長因子-BB。富血小板纖維蛋白浸提液能促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的增殖和遷移，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　4.脂肪來源干細(xì)胞可以在體