小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：l型糖尿病是針對(duì)胰島β細(xì)胞的特異性自身免疫性疾病，需終身依賴(lài)胰島素治療。但是胰島素治療并不能從根本上治愈該病，不僅給患者帶來(lái)很大的痛苦，對(duì)社會(huì)和家庭也是沉重的負(fù)擔(dān)。新的治療策略就是尋找合適的細(xì)胞以替代B細(xì)胞發(fā)揮生理功能。然而，供體來(lái)源的匱乏以及移植免疫排斥反應(yīng)極大地阻礙了該方法的推廣和應(yīng)用。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是‘種具有自我更新和多向分化潛能，存在于骨髓的非造血成體干細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞呈現(xiàn)穩(wěn)定的表型，易于分離、培養(yǎng)，自我復(fù)制，有高

2、度增殖潛力，而且在‘定條件F具有跨系分化潛力。本研究采用干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化技術(shù)，分離培養(yǎng)小鼠骨髓陽(yáng)j質(zhì)于細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)分化為分泌胰島素細(xì)胞。 材料與方法：實(shí)驗(yàn)用雄性成年昆明小鼠(4周～6周)，用5ml注射器沖出股骨、脛骨中的骨髓，分別培養(yǎng)于完全低糖DMEM培養(yǎng)基中l(wèi)小時(shí)，含l％二甲基亞砜的無(wú)血清DMEM中3天和完全高糖DMEM中7天。取培養(yǎng)第1天、第3天、第10天的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化；培養(yǎng)第10天時(shí)

3、細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素、胰高血糖素抗體：以RT-PCR法檢測(cè)第1天和10天時(shí)細(xì)胞內(nèi)Insulin和Glucagon基因的表達(dá)，用westernblot檢測(cè)第lO天時(shí)細(xì)胞內(nèi)胰島素蛋白的表達(dá)，用雙硫腙(DTZ)染色試驗(yàn)檢測(cè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)內(nèi)是否有Insulin合成，以及葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗(yàn)檢驗(yàn)胰島樣細(xì)胞是否能夠初步模擬體內(nèi)β細(xì)胞的生理功能。 結(jié)果： 1．小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng) 接種后可見(jiàn)絕大部分細(xì)胞

4、成圓球形，單個(gè)存在，偶可見(jiàn)未解離的3-5個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)。lh后換為含有1％二甲基亞砜的無(wú)血清DMEM，培養(yǎng)24h后即可見(jiàn)有梭形細(xì)胞貼壁，以后貼壁的細(xì)胞逐漸增多，匯合成灶狀或片狀，而未貼壁的細(xì)胞在換液過(guò)程中逐漸被去除。培養(yǎng)lO天左右，即可見(jiàn)到細(xì)胞相互聚集形成胰島樣細(xì)胞芽團(tuán)。 2．細(xì)胞免疫化學(xué)染色 取培養(yǎng)第10天的細(xì)胞爬片，做胰島素、胰高血糖素細(xì)胞免疫化學(xué)染色，部分細(xì)胞胞質(zhì)呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明這部分骨髓間質(zhì)于細(xì)胞已轉(zhuǎn)分化為胰

5、島樣細(xì)胞。 3．RT-PCR檢測(cè)胰島素及胰高血糖素mRNA的表達(dá) 結(jié)果顯示：培養(yǎng)lO天后Insulin基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，分離第l天，Insulin相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度的積分光密度(integratedopticaldensity，IOD)值為0．372±0．047；10天后，Insulin含量明顯增高，IOD值為1．775±0．166(P

6、080，P

7、ol／L)時(shí)有明顯的增加(5．36±1．54vs134±0．89，P