氧化苦參堿誘導跨膜蛋白Claudin-1表達在重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜損害中的作用.pdf

1、目的:探討氧化苦參堿(OM)靶向調(diào)控跨膜蛋白Claudin-1表達在重癥急性胰腺炎(SAP)腸黏膜屏障損害中的作用及其機制。
　　 方法:采用L-精氨酸(17mg/100g)分2次間隔1h腹腔注射制備SAP大鼠模型。將84只大鼠隨機分為Control組(n=7);OM對照組(n=7);SAP組(n=35),SAP組又分為建模后2h、12h、24h、36h、48h,5個亞組(每亞組7只);OM治療組(n=35),OM治療組又分為建

2、模后2h、12h、24h、36h、48h,5個亞組(每亞組7只)。
　　 Control組:7只大鼠分2次腹腔注射生理鹽水(1.75ml/100g、間隔1h);48h后處死;
　　 OM對照組:7只大鼠,給予氧化苦參堿(50mg/kg)直腸保留灌腸(灌腸后把大鼠吊起,頭向下,治療8分鐘,每24h一次);48h后處死;
　　 SAP組:分為建模后2h、12h、24h、36h、48h,5個亞組(每亞組7只)35只大鼠

3、分2次腹腔注射L-精氨酸溶液(各175mg/100g、間隔1h),建模后2h、12h、24h、36h,48h處死相應(yīng)亞組大鼠;
　　 OM治療組:分為建模后2h、12h、24h、36h、48h,5個亞組(每亞組7只),35只大鼠分2次腹腔注射L-精氨酸溶液(各175mg/100g、間隔1h),第二次注射L-精氨酸后1h開始給予氧化苦參堿(50mg/kg)直腸保留灌腸治療(灌腸后把大鼠吊起,頭向下,治療8分鐘,每24h一次),建模

4、后2h、12h、24h、36h,48h處死相應(yīng)亞組大鼠。
　　 上述各組處死后的大鼠,門靜脈穿刺取血,靜置2h后,以3800r/min離心3min,取血清-20℃凍存;取胰腺組織、結(jié)腸黏膜組織2.5%戊二醛固定,制成石蠟切片保存。
　　 測定血漿淀粉酶、D-乳酸、內(nèi)毒素濃度變化;用熒光定量PCR方法檢測結(jié)腸黏膜組織跨膜蛋白Claudin-1mRNA表達;Westernblot方法檢測結(jié)腸黏膜組織Claudin-1蛋白水平

5、;免疫組化技術(shù)檢測結(jié)腸黏膜組織Claudin-1蛋白表達。胰腺及結(jié)腸黏膜組織進行病理學光鏡觀察;透射電鏡下觀察結(jié)腸黏膜上皮組織細胞緊密連接形態(tài)改變。
　　 結(jié)果:通過對大鼠血漿淀粉酶的測定及胰腺組織HE染色切片的光鏡檢查表明:SAP組、OM治療組的各亞組血漿淀粉酶活性有顯著變化(P＜0.01);Control組與OM對照組比較血漿淀粉酶活性無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);SAP組2h亞組與Control組比較血漿淀粉酶活性顯著升高

6、(P＜0.01),并且在建模后36h達到峰值,之后逐漸下降;HE染色光鏡檢查SAP組2h亞組胰腺組織胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞、消失,腺體數(shù)量減少,小葉間、小葉內(nèi)間隔、腺泡間隔增寬,腺泡細胞局灶性壞死,周圍有炎性細胞浸潤,血管擴張充血并有紅細胞漏到血管外,這說明應(yīng)用L-精氨酸制作大鼠SAP模型成功。
　　 通過對大鼠血漿D-乳酸、內(nèi)毒素濃度檢測發(fā)現(xiàn):Control組與OM對照組比較大鼠血漿D-乳酸、內(nèi)毒素濃度無統(tǒng)計學意義(P＞0.05):

7、SAP組2h亞組與Control組對比血漿D-乳酸、內(nèi)毒素濃度顯著升高(P＜0.01),提示胰腺炎模型早期便存在腸黏膜屏障破壞,腸黏膜通透性增加,細菌移位;OM治療組各亞組與同時間點位的SAP組各亞組進行兩兩比較,OM干預后大鼠血漿D-乳酸、內(nèi)毒素濃度較同時點的SAP各亞組顯著下降(P＜0.05),提示OM干預可修復腸黏膜屏障,恢復腸黏膜通透性,防止細菌移位,從而降低血漿D-乳酸、內(nèi)毒素濃度。
　　 通過對大鼠結(jié)腸黏膜組織中Cl

8、audin-1蛋白表達、Claudin-lmRNA表達及Claudin-1免疫組化光密度分析提示:Control組與OM對照組比較大鼠結(jié)腸黏膜組織中Ciaudin-1表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);SAP組2h亞組與Control組對比結(jié)腸黏膜組織中Claudin-1表達顯著下降(P＜0.01),提示胰腺炎模型早期便發(fā)生結(jié)腸黏膜組織中Claudin-1表達下調(diào);OM治療組各亞組與同時間點位的SAP組各亞組進行兩兩比較提示,OM干預后結(jié)

9、腸黏膜組織中Claudin-1表達逐步恢復,表達增強,36h亞組、48h亞組中OM治療組的Claudin-1表達較同時點SAP組顯著提高(P＜0.05),提示OM有上調(diào)Claudin-1表達的作用。
　　 通過對大鼠結(jié)腸黏膜組織光鏡和電鏡觀察提示:Control組結(jié)腸黏膜腺體排列緊密、規(guī)整,絨毛高度及黏膜層厚度正常;SAP組24h亞組結(jié)腸黏膜間質(zhì)層明顯充血、水腫、淋巴管擴張、絨毛增粗,并見單核細胞及中性粒細胞浸潤,柱狀上皮細胞壞

10、死、脫落、部分絨毛脫落、缺損,絨毛高度降低、黏膜層變薄。SAP組24h亞組與Control組比較結(jié)腸黏膜絨毛高度和隱窩深度明顯降低(P＞0.01);透射電鏡下觀察結(jié)腸黏膜上皮細胞形態(tài)改變:與Control組比較SAP組黏膜上皮細胞表面微絨毛疏松,變長,部分脫落,胞質(zhì)內(nèi)細胞器數(shù)量減少,部分線粒體腫脹,嵴斷裂,呈空泡樣改變,偶見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),表面核糖體脫落,細胞間緊密連接增寬,密度增強。從SAP組及OM治療組2h、12h、24h亞組圖片可見緊

11、密連接的結(jié)構(gòu)發(fā)生中斷、增寬、密度增強,并有局部膜融合。OM治療組48h亞組與SAP組48h亞組圖片比較緊密連接部結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn),得到一定程度的修復。這提示SAP時結(jié)腸黏膜上皮細胞遭到損害,細胞間緊密連接被破壞,而OM干預可有效地恢復細胞間緊密連接,改善腸黏膜屏障功能。
　　 結(jié)論:SAP損傷導致血漿內(nèi)毒素、D-乳酸濃度升高,結(jié)腸黏膜組織Claudin-1mRNA、蛋白表達降低,OM干預可明顯減少血漿內(nèi)毒素、D-乳酸的產(chǎn)生,上調(diào)結(jié)腸