內(nèi)源性H-,2-S介導(dǎo)的缺氧后處理對心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:通過培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心室肌細(xì)胞,建立缺氧/復(fù)氧模型,以模擬在體心肌缺血/再灌注,探討內(nèi)源性H2S介導(dǎo)的缺氧后處理對原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制分析。 方法:采用膠原酶消化法,結(jié)合差速貼壁法和化學(xué)試劑抑制法分離純化1~3天SD大鼠心室肌細(xì)胞,分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和自發(fā)搏動情況,并通過a-肌動蛋白和心肌特異性肌鈣蛋白cTnT免疫熒光法

2、對培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 選用培養(yǎng)72小時的單層心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為分5組:①空白組(Nomal組)心肌細(xì)胞正常培養(yǎng);②缺氧/復(fù)氧組(H/R組)用缺氧液置換正常細(xì)胞培養(yǎng)液,將培養(yǎng)板置于純氮持續(xù)通氣的密閉容器中(37℃)3小時造成缺氧,再用復(fù)氧液置換缺氧液,以純氧孵育1小時(37℃)造成再復(fù)氧;⑨缺氧后處理組(HPC組):缺氧3 h后,先用復(fù)氧液培養(yǎng)5 min,然后換為缺氧液培養(yǎng)5 min,重復(fù)3次,共計(jì)30 min,再繼續(xù)

3、用復(fù)氧液培養(yǎng)1h;④缺氧后處理加L-炔丙基甘氨酸(H2S代謝酶抑制劑)組(H/R+L-PAG組):后處理方式同HPC組,但在3次循環(huán)中的復(fù)氧液中加入10umol/L L-炔丙基甘氨酸;⑤缺氧后處理加白屈菜紅堿(PKC抑制劑)組(H/R+Che組):后處理方式同HPC組,但在3次循環(huán)中的復(fù)氧液中加入3umol/L白屈菜紅堿的復(fù)氧液。在倒置相差顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)及自發(fā)搏動情況,采用化學(xué)比色法測定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放,用激光共

4、聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度,用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況,同時采用硫代巴比妥比色法與黃嘌呤氧化酶法分別測定細(xì)胞丙二醛(MDA)含量及培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶(SOD)活性。 結(jié)果: 1.細(xì)胞鑒定:倒置顯微鏡下可見細(xì)胞成簇生長,有規(guī)律的自發(fā)性搏動,頻率約80~100beat/min。熒光倒置顯微鏡下可見胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光,即胞漿內(nèi)表達(dá)a-肌動蛋白與肌鈣蛋白cTnT,符合心肌細(xì)胞的特征。 2.各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)

5、比較:H/R組細(xì)胞搏動頻率較空白組明顯減弱(18.26±3.50beat/min vs87.74±2.22 beat/min p<0.05);H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比,搏動頻率明顯增高(38.50±2.38beat/min,41.52±2.65beat/min和178.77±2.75beat/minvs18.26±3.50beat/min p<0.05);H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HP

6、C組相比,細(xì)胞搏動頻率明顯降低(p<0.05)。 3.各組細(xì)胞凋亡率的比較:凋亡百分率圖中,B1,B2,B3和B4分別代表晚期凋亡,死亡細(xì)胞,正常細(xì)胞和早期凋亡。H/R組凋亡率較空白組明顯升高(43.72±4.72%vs3.61±0.89%,p<0.05);H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比,凋亡率明顯下降,(17.41±2.56%,19.16±1.47%和8.93±1.04% vs43.72±4.7

7、2%,P<0.05):H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組相比,凋亡率明顯升高(p<0.05)。 4.各組細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的比較:H/R組細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度明顯高于空白組(567.43±45.28 vs112.37±13.67 p<0.05):H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比,細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度均有明顯下降(245.12±19.03,350.28±35.22和170.62±22.07 vs5

8、67.43±45.28,p<0.05):H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組相比,細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度明顯上升(p<0.05)。 5.各組細(xì)胞MDA含量及培養(yǎng)液中SOD活性的比較:H/R組MDA較空白組明顯升高(2.94±0.78 vs0.90±0.12 nmol/L,p<0.05),而SOD活性顯著下降(28.30±19.87 vs58.63±22.03NU/ml,p<0.05);HPC組MDA為0.96±0.017n

9、mol/L,SOD為20.65±0.47NU/ml,均與H/R組有顯著差異(p<0.05);H/R+L-PAG組和H/R+Che組與H/R組相比,MDA明顯降低,SOD活性顯著上升,有顯著差異。(p<0.05) 6.各組細(xì)胞LDH釋放量的比較:H/R組細(xì)胞LDH釋放量明顯高于空白組(59.64±2.71 vs19.31±1.58 U/L, p<0.05);H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比,LDH明顯

10、下降(45.66+1.49,43.27±1.35和37.18±1.63 vs59.64±2.71 U/L,p<0.05);H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組相比,細(xì)胞LDH釋放量有明顯上升(p<0.05)。 結(jié)論: 1.內(nèi)源性H2S參與了心肌細(xì)胞缺氧后處理的保護(hù)作用。 2.內(nèi)源性H2S可減輕缺氧/復(fù)氧脂質(zhì)過氧化,減輕心肌損傷,在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧中具有抗氧化應(yīng)激的作用。 3.內(nèi)源性H2S介導(dǎo)

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