內(nèi)源性H-,2-S介導(dǎo)的缺氧后處理對心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制分析.pdf

1、目的：通過培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心室肌細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧模型，以模擬在體心肌缺血/再灌注，探討內(nèi)源性H2S介導(dǎo)的缺氧后處理對原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制分析。 方法：采用膠原酶消化法，結(jié)合差速貼壁法和化學(xué)試劑抑制法分離純化1～3天SD大鼠心室肌細(xì)胞，分離的心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和自發(fā)搏動情況，并通過a-肌動蛋白和心肌特異性肌鈣蛋白cTnT免疫熒光法

2、對培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 選用培養(yǎng)72小時的單層心肌細(xì)胞進(jìn)行實驗，隨機(jī)分為分5組：①空白組(Nomal組)心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)；②缺氧/復(fù)氧組(H/R組)用缺氧液置換正常細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)板置于純氮持續(xù)通氣的密閉容器中(37℃)3小時造成缺氧，再用復(fù)氧液置換缺氧液，以純氧孵育1小時(37℃)造成再復(fù)氧；⑨缺氧后處理組(HPC組)：缺氧3 h后，先用復(fù)氧液培養(yǎng)5 min，然后換為缺氧液培養(yǎng)5 min，重復(fù)3次，共計30 min，再繼續(xù)

3、用復(fù)氧液培養(yǎng)1h；④缺氧后處理加L-炔丙基甘氨酸(H2S代謝酶抑制劑)組(H/R+L-PAG組)：后處理方式同HPC組，但在3次循環(huán)中的復(fù)氧液中加入10umol/L L-炔丙基甘氨酸；⑤缺氧后處理加白屈菜紅堿(PKC抑制劑)組(H/R+Che組)：后處理方式同HPC組，但在3次循環(huán)中的復(fù)氧液中加入3umol/L白屈菜紅堿的復(fù)氧液。在倒置相差顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)及自發(fā)搏動情況，采用化學(xué)比色法測定乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，用激光共

4、聚焦顯微鏡測定細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況，同時采用硫代巴比妥比色法與黃嘌呤氧化酶法分別測定細(xì)胞丙二醛(MDA)含量及培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶(SOD)活性。 結(jié)果： 1．細(xì)胞鑒定：倒置顯微鏡下可見細(xì)胞成簇生長，有規(guī)律的自發(fā)性搏動，頻率約80～100beat/min。熒光倒置顯微鏡下可見胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達(dá)a-肌動蛋白與肌鈣蛋白cTnT，符合心肌細(xì)胞的特征。 2．各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)

5、比較：H/R組細(xì)胞搏動頻率較空白組明顯減弱(18.26±3.50beat/min vs87.74±2.22 beat/min p＜0.05)；H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比，搏動頻率明顯增高(38.50±2.38beat/min，41.52±2.65beat/min和178.77±2.75beat/minvs18.26±3.50beat/min p＜0.05)；H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HP

6、C組相比，細(xì)胞搏動頻率明顯降低(p＜0.05)。 3．各組細(xì)胞凋亡率的比較：凋亡百分率圖中，B1，B2，B3和B4分別代表晚期凋亡，死亡細(xì)胞，正常細(xì)胞和早期凋亡。H/R組凋亡率較空白組明顯升高(43.72±4.72％vs3.61±0.89％，p＜0.05)；H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比，凋亡率明顯下降，(17.41±2.56％，19.16±1.47％和8.93±1.04％ vs43.72±4.7

7、2％，P＜0.05)：H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組相比，凋亡率明顯升高(p＜0.05)。 4．各組細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的比較：H/R組細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度明顯高于空白組(567.43±45.28 vs112.37±13.67 p＜0.05)：H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度均有明顯下降(245.12±19.03，350.28±35.22和170.62±22.07 vs5

8、67.43±45.28，p＜0.05)：H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度明顯上升(p＜0.05)。 5．各組細(xì)胞MDA含量及培養(yǎng)液中SOD活性的比較：H/R組MDA較空白組明顯升高(2.94±0.78 vs0.90±0.12 nmol/L，p＜0.05)，而SOD活性顯著下降(28.30±19.87 vs58.63±22.03NU/ml，p＜0.05)；HPC組MDA為0.96±0.017n

9、mol/L，SOD為20.65±0.47NU/ml，均與H/R組有顯著差異(p＜0.05)；H/R+L-PAG組和H/R+Che組與H/R組相比，MDA明顯降低，SOD活性顯著上升，有顯著差異。(p＜0.05) 6．各組細(xì)胞LDH釋放量的比較：H/R組細(xì)胞LDH釋放量明顯高于空白組(59.64±2.71 vs19.31±1.58 U/L， p＜0.05)；H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組與H/R組相比，LDH明顯

10、下降(45.66+1.49，43.27±1.35和37.18±1.63 vs59.64±2.71 U/L，p＜0.05)；H/R+L-PAG組、H/R+Che組和HPC組相比，細(xì)胞LDH釋放量有明顯上升(p＜0.05)。 結(jié)論： 1．內(nèi)源性H2S參與了心肌細(xì)胞缺氧后處理的保護(hù)作用。 2．內(nèi)源性H2S可減輕缺氧/復(fù)氧脂質(zhì)過氧化，減輕心肌損傷，在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧中具有抗氧化應(yīng)激的作用。 3．內(nèi)源性H2S介導(dǎo)