VRACs阻斷劑對小膠質(zhì)細(xì)胞生長和活化的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要分三部分進(jìn)行了介紹：
　　第一部分 VRACs阻斷劑對小膠質(zhì)細(xì)胞增殖的調(diào)控及機(jī)制研究
　　目的：探討容積調(diào)控性離子通道(volume-regulated anion channels,VRACs)阻斷劑他莫昔芬( Tamoxifen)和4-(2-butyl-6,7-dichloro-2-cyclopentyl-indan-1-on-5-yl) oxobutyric acid(DCPIB)對小膠質(zhì)細(xì)胞系 BV-2細(xì)胞增

2、殖的影響及作用機(jī)制。
　　方法：不同濃度的Tamoxifen和DCPIB作用于 BV-2細(xì)胞相應(yīng)的時間點后,用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測藥物對細(xì)胞增殖的抑制率;用流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物處理后 BV-2細(xì)胞周期的分布;用Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 CyclinD1的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB可以下調(diào)細(xì)胞生長曲線,抑制BV-2細(xì)胞增殖,與對照組相比有顯著性差異(P<0.0

3、5),該抑制作用明顯呈時間和濃度依賴性。VRACs阻斷劑作用細(xì)胞48 h后,細(xì)胞周期阻滯在 G0/G1期,G2/M期和S期細(xì)胞明顯減少,與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。DCPIB和Tamixifen作用BV-2細(xì)胞72 h后,與對照組相比,CyclinD1蛋白表達(dá)明顯降低。
　　結(jié)論：VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB可以抑制BV-2細(xì)胞增殖,其作用機(jī)制可能與阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)展和下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 Cyc

4、linD1蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　第二部分 VRACs阻斷劑對小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控及機(jī)制研究
　　目的：探討 VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB對小膠質(zhì)細(xì)胞株 BV-2細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。
　　方法：不同濃度的Tamoxifen和DCPIB作用于 BV-2細(xì)胞相應(yīng)的時間點后,用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞的存活率;用流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物處理后 BV-2細(xì)胞凋亡率的變化;線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)

5、檢測實驗濃度 Tamoxifen和DCPIB作用于 BV-2細(xì)胞后線粒體膜電位(Δψm)的變化;用Western blotting檢測細(xì)胞在藥物干預(yù)后凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、Fas及Fas-L的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB可降低 BV-2細(xì)胞的存活率,與對照組相比有顯著性差異(P<0.05),呈時間和濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示實驗濃度Tamoxifen和DCPIB可以明顯誘導(dǎo)

6、 BV-2細(xì)胞凋亡,呈濃度依賴性。Tamoxifen和DCPIB作用BV-2細(xì)胞48 h后,與對照組相比,線粒體膜電位隨著藥物濃度的增加顯著下降(P<0.05)。實驗濃度 DCPIB和Tamixifen作用BV-2細(xì)胞72 h后,促凋亡相關(guān)蛋白Bax、、Fas及Fas-L表達(dá)增強(qiáng),而抗凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2表達(dá)降低。
　　結(jié)論：VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB可以降低 BV-2細(xì)胞存活率,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)線粒體

7、膜電位崩潰,改變凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),其誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制和線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑相關(guān)。
　　第三部分 VRACs阻斷劑對 OGD誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用及機(jī)制研究
　　目的：探討 VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB對氧糖剝奪實驗(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞 BV-2細(xì)胞活化的抑制作用及其作用機(jī)制。
　　方法：將傳代培養(yǎng)的小鼠來源的小膠質(zhì)細(xì)胞系

8、BV-2細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、OGD組、DMSO+OGD組、Tamoxifen(0.1 uM、1uM)+OGD、DCPIB(1 uM、10uM)+OGD組,分別在培養(yǎng)1 h、6 h、12 h后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,收集細(xì)胞上清液,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測細(xì)胞毒性,檢測細(xì)胞上清液中總一氧化氮(Nitric oxide,NO)的含量,酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked i

9、mmunosorbent assay,ELISA)檢測細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測細(xì)胞中iNOS、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)6 h后,與Control組相比,OGD組細(xì)胞突起減少,胞體變的更圓,更加有立體感,形狀趨向阿米巴樣,而在Tamoxifen+OGD組和DCPIB+OGD組,上述細(xì)胞形態(tài)改變較輕。細(xì)胞培養(yǎng)1 h、6 h、12 h后

10、,與Control組相比,OGD組細(xì)胞上清液中NO、IL-1β、TNF-α的含量含量明顯增加,具有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05),而Tamoxifen+OGD組和DCPIB+OGD組細(xì)胞上清液中NO、IL-1β、TNF-α的含量與OGD組比較顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。各組間iNOS、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)沒有明顯變化。
　　結(jié)論：VRACs阻斷劑 Tamoxifen和DCPIB可以抑制OGD誘導(dǎo) BV-