TREM2調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)參與腦保護(hù)作用機(jī)制的研究.pdf

1、心腦血管疾病一直是危害人類健康的“頭號(hào)殺手”，而中國(guó)作為人口老齡化大國(guó)，缺血性腦中風(fēng)的發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重影響國(guó)民健康。自1994年，缺血性腦中風(fēng)已成為中國(guó)大城市中第一位致死性疾病，每10萬(wàn)人口中約有429～620人患此病，每年每10萬(wàn)人口中約有116～142例死亡。腦對(duì)缺血缺氧等刺激非常敏感且耐受能力最差，是最容易發(fā)生缺血再灌注損傷的器官之一，其功能障礙對(duì)人的精神、情感、行為、意識(shí)以及幾乎所有的臟器功能均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。腦缺血損

2、傷后的神經(jīng)炎癥往往貫穿缺血再灌注損傷病理發(fā)展的全過程，強(qiáng)烈的神經(jīng)炎癥反應(yīng)造成的腦繼發(fā)性損傷是目前臨床上非常棘手的問題，因而抑制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥將會(huì)為腦中風(fēng)患者的治療和預(yù)后帶來(lái)曙光。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)免疫細(xì)胞的代表，其在神經(jīng)炎癥中的功能變化受到人們的廣泛關(guān)注。在缺血再灌注損傷的不同時(shí)期，小膠質(zhì)細(xì)胞的功能持續(xù)發(fā)生變化。經(jīng)典激活狀態(tài)（M1 phenotype）的小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥早期釋放大量炎癥因子及氧自由基等有害物質(zhì)，破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性和功能

3、的穩(wěn)定性；而選擇性激活狀態(tài)（M2 phenotype）的小膠質(zhì)細(xì)胞則在炎癥晚期分泌一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，清除壞死或凋亡的神經(jīng)元碎片，促進(jìn)組織膠質(zhì)瘢痕的形成以及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元。因而調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活化狀態(tài)使其趨利避害，減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥，控制疾病的發(fā)生發(fā)展，將是防治缺血后神經(jīng)損傷的新目標(biāo)。II型髓樣細(xì)胞激發(fā)受體（TREM2）是高表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞上的一種免疫球蛋白樣受體，它在自身免疫及炎癥過程中發(fā)揮“負(fù)性調(diào)節(jié)”的有益作用。那么TREM2是不是調(diào)控

4、小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵靶點(diǎn)？調(diào)控TREM2的表達(dá)能否改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能？針對(duì)這些科學(xué)問題，我們通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上調(diào)TREM2的表達(dá)可促使小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變減輕神經(jīng)炎癥，改善缺血后神經(jīng)功能，初步闡明TREM2是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的重要信號(hào)分子，有助于缺血性腦中風(fēng)新型治療手段和藥物的研發(fā)。
　　實(shí)驗(yàn)一：不同功能活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2的表達(dá)
　　目的：觀察TREM2在M1和M2兩種不

5、同功能活化狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，初步明確其與M1和M2活化狀態(tài)的關(guān)系。
　　方法：采用LPS/IFN-γ定向誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，L-4/IL-13定向誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，應(yīng)用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)M1標(biāo)記物iNOS、M2標(biāo)記物Arg-1以及TREM2的表達(dá)。
　　結(jié)果：LPS/IFN-γ組iNOS表達(dá)較control組多（P<0.05），而IL-4/IL-13組Arg-

6、1表達(dá)較control組多（P<0.05），初步將小膠質(zhì)細(xì)胞按功能狀態(tài)區(qū)分開來(lái)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)TREM2在IL-4/IL-13組表達(dá)升高，且與control組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果與Western Blot近乎一致。
　　結(jié)論：TREM2在M2型小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)升高，而在M1型小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)降低。
　　實(shí)驗(yàn)二：腦缺血損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2的表達(dá)
　　目的：觀察腦缺血后

7、再灌注不同時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型標(biāo)記物的變化及TREM2的表達(dá)情況。
　　方法：將27只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠分為Sham組和MCAO組，其中MCAO組小鼠再次隨機(jī)分為4組，即構(gòu)建MCAO動(dòng)物模型后，于再灌注后的6h，24h，3d和7d分別取缺血半暗帶腦組織（n=6），應(yīng)用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測(cè)并觀察梗死同側(cè)區(qū)半暗帶腦組織中iNOS、IL-6、Arg-1、BDNF及TREM2的表達(dá)。

8、　　結(jié)果：再灌注后6h，iNOS的表達(dá)最高（P<0.01），同樣在6h這一時(shí)間點(diǎn)也觀察到IL-6的表達(dá)增加（P<0.001），M1型標(biāo)記物iNOS、IL-6在6h、24h均較對(duì)照組升高，M2型小標(biāo)記物Arg-1和BDNF于再灌注后7d表達(dá)最高（P<0.001）。TREM2的表達(dá)隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高，在3d表達(dá)最高（P<0.001）。
　　結(jié)論：腦缺血損傷后早期以M1型小膠質(zhì)細(xì)胞為主，腦缺血損傷后晚期以M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為

9、主，TREM2在缺血再灌注后3d即M1/M2過渡期表達(dá)最高。
　　實(shí)驗(yàn)三：下調(diào)TREM2的表達(dá)對(duì)腦缺血損傷的影響
　　目的：探討下調(diào)TREM2的表達(dá)后對(duì)腦梗死容積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、神經(jīng)元凋亡的影響。
　　方法：雄性C57BL/6小鼠24只分為以下3組：MCAO組、siRNA組、scrRNA組，其中MCAO組處理方法同前；siRNA組、scrRNA組：側(cè)腦室注射TREM2-siRNA、control siRNA，72 h

10、后構(gòu)建MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1h后再灌注。缺血再灌注后3d取腦組織，通過TTC染色、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（Longa評(píng)分）、TUNEL染色的方法對(duì)腦功能進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果：TUNEL染色結(jié)果顯示TREM2-siRNA組與MCAO組相比，神經(jīng)元凋亡數(shù)目明顯增多（P<0.05），但TREM2-siRNA組的小鼠腦梗死容積和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與MCAO組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：下調(diào)TREM2的表達(dá)后加重神經(jīng)元的凋亡。
　　實(shí)

11、驗(yàn)四：上調(diào)TREM2的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用
　　目的：探討上調(diào)TREM2的表達(dá)后對(duì)腦梗死容積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、神經(jīng)元凋亡的影響。
　　方法：將32只雄性C57BL/6小鼠分為4組：MCAO組、Hsp602.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp605μg組，其中MCAO組處理方法同前；Hsp602.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp605μg組：腹腔注射Hsp60藥物1h后開始構(gòu)建MCAO模型；同樣，將雄性C57B

12、L/6小鼠24只分為Sham組、MCAO組、LV+MCAO組，其中LV+MCAO組：側(cè)腦室注射TREM2-過表達(dá)慢病毒，于10d后構(gòu)建MCAO模型，大腦中動(dòng)脈缺血1 h后再灌，再灌注后3d取材，通過TTC染色、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分（Longa評(píng)分）、TUNEL染色的方法評(píng)估腦功能。
　　結(jié)果：Hsp605μg組與MCAO組相比，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以及腦梗死容積減少均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），TUNEL染色表明Hsp603.75μg組、

13、Hsp605μg組與MCAO組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)量有所減少（P<0.01）。LV+MCAO組與MCAO組相比，腦梗死容積有所減少（P<0.05），M1標(biāo)記物iNOS表達(dá)降低（P<0.01）而M2標(biāo)記物Arg-1表達(dá)升高（P<0.001）。
　　結(jié)論：Hsp60激活TREM2的表達(dá)，能夠改善缺血再灌注后神經(jīng)功能，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用；TREM2-過表達(dá)慢病毒上調(diào)TREM2的表達(dá)，同樣發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)五：慢病毒調(diào)控TREM

14、2的表達(dá)對(duì)氧糖剝奪模型后小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)的影響
　　目的：進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證調(diào)控TREM2的表達(dá)能夠改變?nèi)毖笮∧z質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)。
　　方法：將N9小膠質(zhì)細(xì)胞分為以下三組，control-vector組、TREM2-vector組、TREM2-siRNA組，慢病毒轉(zhuǎn)染3d后將細(xì)胞給予氧糖剝奪模型處理4h，隨后復(fù)糖復(fù)氧24h，接著收集細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白用Western Blot的方法檢測(cè)iNOS、IL-6、BDN