APRIL阻斷劑BCMA-Fc的表達、純化及活性研究.pdf

1、TNF超家族在細胞增殖、分化和死亡中起著十分重要的作用。其主要成員TNFa，TNFb(LTa)，LTb，TRAIL，F(xiàn)AS配體等，在免疫調節(jié)及免疫應答中的作用已被廣泛認識。增殖誘導配體APRIL和B淋巴細胞刺激因子BAFF(又名:Blys)是TNF配體超家族新近發(fā)現(xiàn)的兩個關系密切的成員。通過與其受體BAFF-R，BCMA，TACI相互作用，在B淋巴細胞生長、分化和發(fā)育，抗體類型轉換、生發(fā)中心維持以及T細胞共刺激等方面發(fā)揮著重要的作用。<

2、br>　　BAFF/APRIL系統(tǒng)(BAFF, APRIL和它們的受體)在自身免疫性疾病和B淋巴細胞系惡性腫瘤的發(fā)生和維持過程中發(fā)揮重要的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風濕性關節(jié)炎，多發(fā)性硬化以及一些惡性腫瘤中，BAFF和APRIL的表達水平升高。BAFF/APRIL系統(tǒng)成為研究自身免疫性疾病藥物的新的靶點。利用抗體或欺騙性受體阻斷過多BAFF/APRIL成為治療自身免疫性疾病的有效方法。
　　分子模擬技術為蛋白質的研究提

3、供了一種嶄新的手段，在理論上解決了結構預測和功能分析以及蛋白質工程實施方面所面臨的難題。它在蛋白質的結構預測和模建工作中占有舉足輕重的地位，實現(xiàn)了生物技術與計算機技術的完美結合。通過分子模擬技術設計欺騙性受體BCMA-Fc融合蛋白三維結構模型，通過分子對接預測BCMA-Fc具備結合APRIL的能力。
　　由于畢赤酵母表達系統(tǒng)具有易操作，生長速度快，營養(yǎng)要求低以及表達量高等優(yōu)點，因此選擇畢赤酵母菌種GS115作為目的基因BCMA-F

4、c的宿主表達菌，選擇pPIC9K質粒作為表達載體。實驗中發(fā)現(xiàn)商業(yè)化質粒pPIC9K轉化畢赤酵母表達的目的蛋白N末端不均一。這是由于α-factor信號肽序列加工過程中兩種信號肽酶Kex2和Stel13作用位點不同造成的。在此基礎上重新改造商業(yè)化質粒pPIC9K使其表達的目的蛋白的具有原始的，均一的N末端。畢赤酵母表達系統(tǒng)作為真核生物表達系統(tǒng)具有對表達的蛋白翻譯后加工和修飾的優(yōu)點，其中包括對表達外源蛋白過進行糖基化修飾，形成糖蛋白。但是由

5、于修飾后蛋白質的糖鏈長度不同造成外源蛋白的分子量大小不同。根據畢赤酵母蛋白質糖基化修飾位點的特點，通過目的基因序列與目的蛋白氨基酸序列比對分析后，對目的蛋白糖基化位點基因序列進行點突變形成具有均一分子量的目的蛋白。酵母菌對外源基因的表達與外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統(tǒng)宿主在密碼子使用上的偏愛性對目的蛋白的基因序列進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后基因序列在畢赤酵母中目的蛋白的表達量的顯著提高。為了進一步的研究BCMA-Fc的生物活性功能，需

6、要獲得大量的目的蛋白，對BCMA-Fc進行畢赤酵母發(fā)酵研究和目的蛋白純化條件的優(yōu)化。發(fā)酵研究中主要針對培養(yǎng)基的組成，誘導方式以及誘導條件(溫度，pH)等進行優(yōu)化，最終通過優(yōu)化后的發(fā)酵條件實現(xiàn)了目的蛋白在畢赤酵母中的高表達。由于BCMA-Fc融合蛋白中具有IgG1Fc片段，可以與ProteinA進行結合利于純化，提高了純化的效率。細胞外活性實驗顯示目的蛋白BCMA-Fc具備配體APRIL結合能力，細胞活性實驗說明BCMA-Fc可以阻斷AP

7、RIL對Raji B淋巴細胞瘤的增殖。實驗證明畢赤酵母表達的BCMA-Fc具有完整的生物學活性。
　　為了比較不同表達系統(tǒng)對目的蛋白BCMA-Fc的影響，選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)對目的蛋白進行表達。大腸桿菌表達目的基因的主要優(yōu)勢:一個是宿主的遺傳背景比較清楚，易于控制基因的表達;另一個是大腸桿菌容易培養(yǎng)，可以獲得較高產量的目的蛋白。另外，一些改造的大腸桿菌宿主細胞中含有硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶基因利于形成正確折疊的含有二硫鍵的

8、蛋白，增強蛋白的可溶性。選擇pET28a和pET23d質粒作為BCMA-Fc基因的表達載體，并對pET28a質粒進行改造使其作為表達載體進行目的基因表達時增加目的蛋白的可溶性。但是為了適應宿主細胞的要求，選擇pET23d作為目的基因的表達載體。構建pET23d-BCMA-Fc質粒，轉化大腸桿菌，進行IPTG誘導表達實現(xiàn)了BCMA-Fc的可溶性表達。通過rProteinA親和層析，分子篩，Q柱進行純化。細胞外活性檢測顯示目的蛋白BCMA-

9、Fc具備配體APRIL結合能力，細胞活性實驗說明BCMA-Fc阻斷APRIL對Raji B淋巴細胞瘤的增殖的作用并且和畢赤酵母表達的目的蛋白BCMA-Fc的細胞活性沒有差別。
　　搖瓶表達研究的基礎上我們對目的蛋白進行BCMA-Fc大腸桿菌發(fā)酵研究，通過20L發(fā)酵罐進行LB培養(yǎng)，IPTG誘導表達以及純化研究。為了進一步研究目的蛋白的活性，我們建立MOG抗原誘導的自身免疫性腦脊髓炎模型檢測蛋白活性。實驗性自身免疫性腦脊髓炎是研究多發(fā)

10、性硬化的經典動物模型，是由同種型、異種型神經組織抗原誘導的中樞神經系統(tǒng)白質免疫炎性脫髓鞘性模型。其病理特征和MS相似，均表現(xiàn)為CNS白質脫髓鞘改變和炎性細胞浸潤。對發(fā)病的動物模型進行病理學切片分析，HE染色光鏡下可見EAE組小鼠腦組織和脊髓組織中有大量的炎性細胞浸潤。初步建立了EAE動物模型，并為目的蛋白生物體內活性實驗的研究奠定了基礎。
　　我們分別利用畢赤酵母和大腸桿菌表達系統(tǒng)實現(xiàn)了達目的蛋白BCMA-Fc的高效表達，進行活性