不同劑量嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是一種臨床上常見(jiàn)的高致殘性疾病，也是臨床疑難病癥之一，其治療困難，方法不一。目前大量研究發(fā)現(xiàn)嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells，OECs)移植能夠促進(jìn)脊髓損傷后軸突再生和神經(jīng)功能修復(fù)，被認(rèn)為是治療脊髓損傷最有前景的細(xì)胞之一。前期實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療急性脊髓損傷有較好的療效，與局部移植療效相似。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療急慢性SCI，研究OE

2、Cs靜脈移植劑量與其療效的關(guān)系，以及其治療陳舊性脊髓損傷的療效，為臨床應(yīng)用嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療急性和陳舊性脊髓損傷提供理論依據(jù)。
　　 第一部分:
　　 不同劑量嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 研究和探討嗅鞘細(xì)胞靜脈移植劑量與其治療急性SCI的療效的關(guān)系，探求較佳的靜脈移植劑量。
　　 方法:
　　 1.嗅鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化與鑒定、細(xì)胞標(biāo)記和計(jì)數(shù):

3、>　　 根據(jù)改良Nash差速貼壁法和Ara-c抑制法相結(jié)合的方法進(jìn)行嗅鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)和純化，并應(yīng)用NGFRp75和GFAP鑒定OECs。消化收集細(xì)胞并用雙苯亞甲胺標(biāo)記細(xì)胞核，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)備移植用。
　　 2.脊髓損傷動(dòng)物模型的制備、分組:
　　 制備wistar大鼠T10左側(cè)脊髓半切損傷模型，隨機(jī)分成5組（每組10只）:嗅鞘細(xì)胞大劑量靜脈移植組（A組）、嗅鞘細(xì)胞中劑量靜脈移植組（B組）、嗅鞘細(xì)胞小劑量靜脈移植組（C組）

4、、D/F12細(xì)胞培養(yǎng)液移植組（D組）、空白對(duì)照組（E組）。
　　 3.神經(jīng)功能評(píng)價(jià):
　　 分別于術(shù)后第1d、1w、2w、3w、4w、6w、8w、10w，通過(guò)聯(lián)合行為學(xué)評(píng)分(CBS評(píng)分法），對(duì)每組大鼠分別進(jìn)行后肢的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能評(píng)分，評(píng)價(jià)脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況。分別于術(shù)后4周、10周，于各組隨機(jī)抽取2只大鼠進(jìn)行脊髓組織取材、切片，通過(guò)HE染色、嗜銀染色，觀察脊髓損傷區(qū)域瘢痕增生以及神經(jīng)纖維軸突再生情況并記錄，比較各組神經(jīng)纖

5、維軸突再生數(shù)量、形態(tài)以及跨越損傷部位的情況，通過(guò)神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFRp75)免疫組化染色檢測(cè)OECs在SCI區(qū)域的存活、分布情況。
　　 結(jié)果:
　　 CBS評(píng)分顯示A組、B組從第2周開(kāi)始在每個(gè)時(shí)間段與C組、D組、E組相比均有顯著性差異(p＜0.05)。A組、B組之間沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)，D組、E組之間沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)，C組與D組、E組之間差異雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但是均數(shù)差別較小

6、。
　　 鏡下觀察:A組、B組在脊髓損傷部位有較多神經(jīng)纖維軸突再生，并且部分再生軸突能夠通過(guò)損傷部位的瘢痕組織;C組、D組、E組僅有極少量神經(jīng)纖維軸突再生，但未發(fā)現(xiàn)有再生軸突通過(guò)瘢痕組織。A組、B組與C組、D組、E組有明顯差別，D組、E組差別不大，A組、B組差別不大。A、B兩組脊髓修復(fù)明顯好于C、D、E組，C組好于D、E組。
　　 結(jié)論:
　　 OECs靜脈移植治療急性脊髓損傷有一定的療效，并且療效與移植的細(xì)胞劑

7、量在一定范圍內(nèi)成正向關(guān)系。OECs靜脈移植治療急性脊髓損傷較佳的移植劑量為2×106。
　　 第二部分:
　　 嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療陳舊性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:
　　 探討嗅鞘細(xì)胞靜脈移植治療陳舊性脊髓損傷的可行性以及療效
　　 方法:
　　 制備wistar大鼠T10左側(cè)脊髓半切損傷模型（不做任何處理，自行恢復(fù)1月），大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)變緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期，并通過(guò)CBS評(píng)分法，每

8、只大鼠的評(píng)分在47分左右，隨機(jī)分成3組（每組10只）:嗅鞘細(xì)胞靜脈移植組（F組）、D/F12細(xì)胞培養(yǎng)液靜脈移植組（G組）、空白對(duì)照組（H組）。通過(guò)CBS評(píng)分法定期對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察脊髓損傷部位組織的修復(fù)情況。
　　 結(jié)果:
　　 CBS評(píng)分顯示:從第2周開(kāi)始在每個(gè)時(shí)間段F組與G組、H組均有顯著差異(p＜0.05)，G、H組之間沒(méi)有顯著性差異(p＞0.05)。鏡下觀察可見(jiàn):F組與G組、H組有明顯差