嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷時(shí)機(jī)選擇的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展，脊髓損傷(Spinalcordinjury，SCI)已經(jīng)成為一種發(fā)病率較高的疾病。脊髓損傷常導(dǎo)致嚴(yán)重的傷殘，脊髓神經(jīng)修復(fù)與肢體功能恢復(fù)至今仍然是世界醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的治療難題。近年來，在治療脊髓損傷的移植細(xì)胞中，由于嗅鞘細(xì)胞(Olfactoryensheathingcells，OECs)擁有獨(dú)特的生物學(xué)特性以及能夠促進(jìn)損傷軸突再生的能力，使嗅鞘細(xì)胞成為前景廣闊的移植細(xì)胞之一。當(dāng)前，嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷的時(shí)機(jī)選擇仍存在較大爭議

2、，國內(nèi)外相關(guān)研究較少，沒有檢索到比較有說服力的研究報(bào)道。
　　目的：
　　通過研究嗅鞘細(xì)胞移植時(shí)機(jī)對(duì)脊髓損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的影響及可能存在的作用機(jī)制，用于指導(dǎo)臨床工作中治療脊髓損傷適宜移植時(shí)間的選擇，更好的促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)與再生。
　　材料與方法：
　　1.嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)、純化、鑒定、標(biāo)記與計(jì)數(shù)
　　選取2月齡的健康Wistar大鼠，雌雄不限，體重200～250g。將Wistar大鼠麻醉后，手術(shù)開顱、取出兩

3、側(cè)嗅球。用改良Nash差速貼壁和阿糖胞苷(Ara-c)抑制相結(jié)合的細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行嗅鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)、純化、鑒定，消化收集計(jì)數(shù)嗅鞘細(xì)胞，并用雙苯亞甲胺進(jìn)行細(xì)胞核標(biāo)記。
　　2.脊髓損傷動(dòng)物模型的建立、分組與髓內(nèi)移植
　　健康成年Wistar大鼠80只，運(yùn)用外科手術(shù)的方法建立左半側(cè)T10脊髓半切損傷模型。將動(dòng)物模型隨機(jī)分為8組:脊髓損傷后立刻移植組(A1組)、脊髓損傷后1周移植組（B1組）、脊髓損傷后4周移植組(C1組)和脊髓損

4、傷后8周移植組（D1組），同時(shí)，每組均設(shè)立相應(yīng)空白對(duì)照組（分別為A2組、B2組、C2組、D2組）。
　　3.損傷脊髓神經(jīng)修復(fù)的評(píng)價(jià)
　　分別選擇移植術(shù)后1周、2周、4周、6周、8周應(yīng)用大鼠聯(lián)合行為學(xué)評(píng)分法（改良CBS評(píng)分）對(duì)大鼠的肢體功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，觀察SCI模型運(yùn)動(dòng)功能情況;移植術(shù)后4周、8周制備脊髓標(biāo)本，首先觀察大體形態(tài)改變，然后將標(biāo)本HE染色和嗜銀染色，查看損傷部位脊髓神經(jīng)軸突的再生情況，最后行免疫組化染色，熒光顯微鏡觀

5、察標(biāo)記嗅鞘細(xì)胞在脊髓損傷部位的存活以及分布。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用差速貼壁和Ara-c抑制相結(jié)合的純化培養(yǎng)方法培養(yǎng)出純度較高的嗅鞘細(xì)胞，可以得到數(shù)量為1×108個(gè)/ml、純度達(dá)70％以上的細(xì)胞，符合實(shí)驗(yàn)所需要求。經(jīng)培養(yǎng)、純化7天后細(xì)胞密度增大，細(xì)胞突起纖細(xì)，雙極、三極細(xì)胞所占比例較大，胞體呈現(xiàn)梭形、扁圓形和多突起形三種形態(tài)，NGFRp75和GFAP染色反應(yīng)陽性。
　　2.移植術(shù)后大鼠運(yùn)動(dòng)功能隨時(shí)間逐漸恢復(fù)。移植4周

6、后CBS評(píng)分可見:A1組、B1組和C1組和D1組之間比較差別有顯著意義(P＜0.05);其中A1組與B1組之間比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，療效相似，A1組略優(yōu)于B1組;C1組療效中等;D1組最差?？瞻讓?duì)照組改善不顯著。
　　3.移植術(shù)后8周A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2組CBS評(píng)分分別為10.60±0.96、12.10±2.91、20.20±1.98、17.10±1.19、35.10±2.28、36.80

7、±2.04、30.10±1.66、29.50±0.52。通過觀察，HE染色和嗜銀染色見A1組、B1組、C1組均有較多的再生軸突，部分再生神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)，D1組損傷脊髓處有空洞形成，再生軸突的數(shù)量少、散在且無連續(xù)性神經(jīng)纖維通過損傷區(qū)。術(shù)后4周時(shí)，免疫組化染色和熒光顯微鏡觀察均在損傷部位發(fā)現(xiàn)存活的OECs，其中細(xì)胞數(shù)量:A1組＞B1組＞C1組＞D1組。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用差速貼壁和Ara-c抑制相結(jié)合的方法純化培