人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合移植治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 脊髓損傷是常見(jiàn)創(chuàng)傷，已經(jīng)成為青壯年殘疾、喪生勞動(dòng)力的重要原因之一。脊髓損傷目前治療的主要手段有藥物治療，手術(shù)治療及康復(fù)訓(xùn)練。藥物治療主要針對(duì)減輕既發(fā)性損傷，目前有效藥物種類(lèi)少(目前臨床常用并獲得較廣泛共識(shí)的僅為糖皮質(zhì)激素類(lèi)和神經(jīng)節(jié)苷脂)，強(qiáng)調(diào)藥物應(yīng)用的時(shí)效性，如損傷后8小時(shí)內(nèi)大劑量甲基強(qiáng)的松龍是唯一經(jīng)美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)并通過(guò)Ⅲ期臨床試驗(yàn)的藥物。復(fù)位，減壓，固定以維持脊柱的穩(wěn)定，避免不適當(dāng)?shù)陌徇\(yùn)方法及治

2、療手段造成脊髓的二次損傷及持續(xù)損傷是手術(shù)治療首要解決的問(wèn)題。手術(shù)治療的另一方面是通過(guò)移植具有治療作用的種子細(xì)胞，促進(jìn)脊髓損傷的功能恢復(fù)?？祻?fù)治療的目的是挖掘其自身潛力，最大限度地發(fā)揮殘存功能，提高患者的生存質(zhì)量。 脊髓損傷后造成損傷平面以下的肢體癱瘓是目前治療上面臨的最重要問(wèn)題。目前認(rèn)為移植具有治療作用的種子細(xì)胞是這方面最有可能取得突破的方法。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(marrowmesenchymalstemcells，MSCs)與嗅鞘

3、細(xì)胞(olfactoryensheathingcells，OECs)是近年來(lái)倍受人們關(guān)注的候選種子細(xì)胞。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞從骨髓中分離，來(lái)源豐富，在體外培養(yǎng)能保持其多向分化潛能，可在脊髓損傷處長(zhǎng)期存活并可向神經(jīng)細(xì)胞方向分化替代喪失神經(jīng)元參與重建神經(jīng)傳導(dǎo)通路，但僅在脊髓損傷微環(huán)境誘導(dǎo)下分化為神經(jīng)元的數(shù)量很少，限制了其更好的發(fā)揮修復(fù)功能；經(jīng)體外定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡、死亡大量增加，植入體內(nèi)后存活細(xì)胞很少。嗅鞘細(xì)胞是存在于嗅球的最外兩

4、層以及嗅黏膜上皮中的一種特殊的大膠質(zhì)細(xì)胞，在嗅神經(jīng)終生再生或修復(fù)中發(fā)揮重要功能，在一定程度上可促進(jìn)脊髓損傷神經(jīng)再生及軸突的髓鞘化。新的觀點(diǎn)認(rèn)為嗅鞘細(xì)胞在嗅覺(jué)系統(tǒng)中，不僅可通過(guò)分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)嗅神經(jīng)元的存活及再生，而且可與嗅覺(jué)系統(tǒng)的干細(xì)胞相互作用，促進(jìn)干細(xì)胞向嗅神經(jīng)方向分化，促進(jìn)嗅神經(jīng)的成熟。最近王葵光等發(fā)現(xiàn)嗅鞘細(xì)胞可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，沈慧勇等認(rèn)為嗅鞘細(xì)胞可以啟動(dòng)與之共培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的程序。因此本實(shí)驗(yàn)研

5、究聯(lián)合移植人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎嗅鞘細(xì)胞對(duì)脊髓損傷修復(fù)的治療效果。 目的： 觀察人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合移植治療脊髓損傷的治療效果，探討共移植的嗅鞘細(xì)胞對(duì)脊髓骨髓間質(zhì)干細(xì)胞源性細(xì)胞分化的影響。 方法： 從成人骨髓分離培養(yǎng)人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，從流產(chǎn)胚胎嗅球分離培養(yǎng)人胚胎嗅鞘細(xì)胞。60只SD大鼠采用ALLEN法制作脊髓急性損傷模型，隨機(jī)分為四組：骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植組，嗅鞘細(xì)胞移植組，聯(lián)合移植組，PBS

6、移植對(duì)照組，在損傷局部移植相應(yīng)細(xì)胞。采用BBB后肢功能評(píng)分比較大鼠后肢功能恢復(fù)情況；運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期評(píng)估脊髓傳導(dǎo)性能改善情況；細(xì)胞移植5周后，采用組織學(xué)方法分析脊髓病理改變、軸突再生、植入嗅鞘細(xì)胞和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的存活與分化情況。 結(jié)果： 1.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源豐富，可從骨髓中分離，一般培養(yǎng)條件下易大量擴(kuò)增，傳代培養(yǎng)生物學(xué)特性穩(wěn)定，保持多分化潛能；嗅鞘細(xì)胞取材于經(jīng)水囊引產(chǎn)的胚胎嗅球，而藥物引產(chǎn)的胚胎分離培養(yǎng)不易成功，故

7、嗅鞘細(xì)胞來(lái)源明顯受限，且一般培養(yǎng)條件不易大量擴(kuò)增，細(xì)胞易老化。兩者均不表達(dá)與移植免疫排斥發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞表面抗原。 2.BBB后肢功能評(píng)分從第1周起所有治療組均比對(duì)照組高；第2周起聯(lián)合移植組比其他組高，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞組比嗅鞘細(xì)胞組高。 3.顱磁刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)，在第1周末，僅3只鼠引出誘發(fā)電位，第2周所有大鼠均恢復(fù)，潛伏期明顯延長(zhǎng)。第2周-4周，潛伏期隨時(shí)間有所回復(fù)，各組動(dòng)物潛伏期比前一星期回復(fù)明顯，第4周-5周各

8、組潛伏期不再隨時(shí)間而明顯回落，基本維持穩(wěn)定；第2周-5周，聯(lián)合移植組比其他組潛伏期回復(fù)明顯，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞組與嗅鞘細(xì)胞組均比對(duì)照組恢復(fù)明顯，但兩組間差別沒(méi)有顯著性。 4.組織病理改變分析。1-2周HE染色可觀察到脊髓損傷處灰質(zhì)內(nèi)大面積出血；神經(jīng)元萎縮，胞質(zhì)收縮；白質(zhì)軸索變性，壞死，成空泡樣改變；大量小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)樣增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變。細(xì)胞移植后5周HE染色可觀察到脊髓結(jié)構(gòu)破壞，損傷中央及毗鄰區(qū)大量神經(jīng)元萎縮，消失；偶可

9、見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)樣增生；灰白質(zhì)分界模糊，可見(jiàn)囊性軟化灶，軸索變性，空泡樣改變等。各組大鼠均可存在上述改變，個(gè)體差異較大，程度略有不同，各組病理改變沒(méi)有明顯的區(qū)別。 5.再生軸突的觀察。甘氨酸銀浸鍍法染色，對(duì)照組脊髓損傷區(qū)近端可觀察到再生神經(jīng)軸突極少，損傷區(qū)幾乎不見(jiàn)軸突。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞組及嗅鞘細(xì)胞組脊髓損傷區(qū)近端可觀察到較多再生神經(jīng)軸突，并向損傷區(qū)伸展，距離較長(zhǎng)，部分抵達(dá)損傷處，損傷區(qū)可觀察到神經(jīng)軸突稀疏分布。聯(lián)合移植組脊髓損傷區(qū)近

10、端可觀察到大量再生神經(jīng)軸突，成束向損傷邊緣延伸，在損傷區(qū)可觀察到較多神經(jīng)軸突，分布較密。各組均未發(fā)現(xiàn)再生神經(jīng)軸突成束穿越損傷區(qū)的直接證據(jù)。 6.植入細(xì)胞的追蹤。聯(lián)合移植組及嗅鞘細(xì)胞組切片上可觀察到Hoechst標(biāo)記的移植細(xì)胞，主要分布于損傷區(qū)后索區(qū)域：聯(lián)合移植組及骨髓間質(zhì)干細(xì)胞組切片可觀察到Brdu標(biāo)記細(xì)胞主要分布于損傷區(qū)后索區(qū)域及后角部分區(qū)域。聯(lián)合移植組脊髓MSCs源性細(xì)胞表達(dá)Nestin，NF的細(xì)胞百分比均比MSCs移植組高

11、，MSCs源性細(xì)胞表達(dá)GFAP的細(xì)胞百分比兩組間沒(méi)有明顯差別。 結(jié)論： 1.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷的機(jī)理有所不同，治療效果相近，前者在移植細(xì)胞來(lái)源及制備上具有明顯優(yōu)勢(shì)。 2.骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合移植時(shí)，共移植胚胎嗅鞘細(xì)胞可促進(jìn)脊髓骨髓間質(zhì)干細(xì)胞源性細(xì)胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化，提高骨髓間質(zhì)干細(xì)胞源性細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例；共移植骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與胚胎嗅鞘細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中可以發(fā)揮協(xié)同作用，與