人嗅鞘細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬首先通過OECs與MSCs聯(lián)合培養(yǎng)，了解OECs對MSCs增殖分化的影響，并探討其可能的作用機(jī)制；制造大鼠脊髓打擊傷模型，利用BBB運(yùn)動功能評分、組織病理學(xué)、免疫組化檢測及超微結(jié)構(gòu)觀察，分析和評價(jià)純化培養(yǎng)OECs、MSCs異體移植對急性SCI大鼠運(yùn)動功能的修復(fù)作用及遠(yuǎn)期效果，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用OECs、MSCs移植治療SCI提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)方法。研究內(nèi)容包括兩部分：　　第一部分：嗅鞘細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的

2、初步建立；　　第二部分：嗅鞘細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)觀察。 研究方法：取5個(gè)月以上因意外終止妊娠的胎兒骨髓及嗅球，分離培養(yǎng)MSCs及OECs，分別行流式細(xì)胞儀及免疫細(xì)胞化學(xué)等鑒定。攜帶綠色熒光蛋白基因的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染OECs，雙苯亞甲胺熒光染料標(biāo)記MSCs，采用兩種不同方法(直接混合培養(yǎng)、Transwell培養(yǎng)體系)各三組(OECs：MSCs=10∶1、1∶1、1∶10)進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)，7d后改換復(fù)

3、方丹參注射液誘導(dǎo)5h，免疫細(xì)胞化學(xué)共聚焦顯微鏡觀察MSCs表達(dá)巢蛋白(nestin)、神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)絲蛋白(NF-M)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)情況。改良Allen打擊器致大鼠T1O脊髓損傷，即刻隨機(jī)分為4組(OECs+MSCs聯(lián)合移植組、OECs移植組、MSCs移植組、空白對照組)進(jìn)行細(xì)胞移植，通過BBB運(yùn)動評分觀察各組大鼠后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況、組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察脊髓損傷

4、程度及軸突再生數(shù)量、冰凍切片免疫熒光化學(xué)檢測OECs存活及MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化率情況，分析和評價(jià)純化培養(yǎng)的人OECs、MSCs異體移植對急性SCI的修復(fù)作用。 研究結(jié)果： 1.分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定是MSCs、OECs，攜帶綠色熒光蛋白基因的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染OECs效率高、熒光強(qiáng)度合適，GFP可在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，對細(xì)胞生長活性未見明顯影響；Hoechst標(biāo)記MSCs胞核，不影響干細(xì)胞活性。 2.共培養(yǎng)體系初步建立成

5、功，兩種細(xì)胞生長良好，未見明顯接觸抑制現(xiàn)象，經(jīng)復(fù)方丹參注射液誘導(dǎo)后部分MSCs呈現(xiàn)神經(jīng)元樣改變，表達(dá)nestin、NSE、NeuN、NF-M、GFAP等特異性標(biāo)志，且共培養(yǎng)組的分化率明顯高于單獨(dú)MSCs培養(yǎng)組，有顯著性差異。 3.大鼠脊髓損傷模型建立成功，移植3周后，細(xì)胞移植組大鼠BBB運(yùn)動功能評分明顯優(yōu)于空白對照組，6周時(shí)聯(lián)合移植組BBB評分明顯優(yōu)于單獨(dú)移植組；植入細(xì)胞與損傷部位組織整合良好，聯(lián)合移植組MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化率

6、高于單獨(dú)MSCs移植組，且穿越瘢痕區(qū)的再生軸突數(shù)量多。 研究結(jié)論： 1.攜帶綠色熒光蛋白基因的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染OECs效率高、方法簡單、對細(xì)胞生物學(xué)活性無影響，能夠滿足體外活細(xì)胞觀察及體內(nèi)移植示蹤需求，是標(biāo)記嗅鞘細(xì)胞較為理想的示蹤方法。 2.OECs與MSCs體外共培養(yǎng)時(shí)能夠相互促進(jìn)增殖，OECs可能通過分泌某些可溶性物質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用啟動了MSCs分化程序，使MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化效率更高。 3.S