經(jīng)門靜脈移植Feridex標(biāo)記的HMSCs在大鼠肝內(nèi)的存活情況及示蹤研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著干細(xì)胞日益受到重視，不少研究已經(jīng)表明，干細(xì)胞具有修復(fù)損傷性疾病及多向分化能力；在此基礎(chǔ)上，為了研究其修復(fù)病理的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)人員利用體外標(biāo)記及移植等方法研究其在體內(nèi)的“運(yùn)動(dòng)軌跡”及存活情況。隨著標(biāo)記物的更新?lián)Q代，超順磁氧化鐵(SPIO)由于具有良好的特性，同時(shí)配合MR成像系統(tǒng)的無(wú)創(chuàng)顯影，已經(jīng)成為現(xiàn)階段干細(xì)胞研究最重要的組成部分之一。動(dòng)物的體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步證明了干細(xì)胞在移植受體體內(nèi)的存活，并表明了移植干細(xì)胞在受體體內(nèi)的定位、

2、遷徙等情況，利用成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(HMSCs)進(jìn)行研究也已有不少報(bào)導(dǎo)。然而，這種實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)“鐵顆?！绷私庖浦驳母杉?xì)胞在體內(nèi)的情況，并未直接明確移植細(xì)胞的存活。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠肝纖維化模型，體外菲力磁(Feridex，SPIO的一種)標(biāo)記HMSCs，并通過(guò)門靜脈途徑移植入大鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)取大鼠肝組織，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)及普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)，尋找兩種方法在不同時(shí)間點(diǎn)之間聯(lián)系及區(qū)別。主要研究?jī)?nèi)容如下： 一、體外分離、培

3、養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及Feridex標(biāo)記 無(wú)菌條件下取成人骨髓，利用Percoll分離液進(jìn)行梯度離心獲取HMSCs，體外培養(yǎng)、傳代及提純，再通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD45/CD14/CD44/CD29/CD105等表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定；并利用成脂、成骨誘導(dǎo)方法進(jìn)一步驗(yàn)證HMSCs向脂、向骨分化潛能。使用不同濃度Feridex標(biāo)記HMSCs，利用鐵染色確定染色成功，同時(shí)通過(guò)MTT法(四甲基偶氮唑鹽比色法)確定標(biāo)記的最合適Feridex濃

4、度。 結(jié)果顯示原代HMSCs生長(zhǎng)較慢，以克隆集落方式增殖，培養(yǎng)早期細(xì)胞表現(xiàn)為短梭形、三角形或星形等多種形態(tài)。之后，細(xì)胞集落逐漸融合，細(xì)胞形態(tài)也漸趨均一，呈長(zhǎng)梭形或纖維狀。至第12～14d，細(xì)胞已基本融合，形態(tài)均一，呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯增快，形態(tài)及分布也更為均勻一致。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3～4代HMSCs，結(jié)果為：CD45-/CD14-/CD44+/CD29+/CD105+，符合HMSCs特征；經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)

5、后，HMSCs可以成脂、成骨分化。MTT法結(jié)果：終濃度為25ug/ml的Feridex標(biāo)記HMSCs后，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與未標(biāo)記組幾近重合；25ug/ml的Feridex標(biāo)記HMSCs后1天，鐵染色提示染色均勻，藍(lán)染率將近100％。 二、經(jīng)門靜脈移植Feridex標(biāo)記的HMSCs在大鼠肝內(nèi)的存活情況及示蹤 使用CCl4及植物油配置成4：6溶液，按大鼠體重每100g使用0.3ml混合溶液計(jì)算，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，首

6、劑加倍，每周2次，共8周；HE染色證明大鼠肝纖維化模型建立成功。用終濃度為25ug/ml的Feridex體外標(biāo)記第3～6代HMSCs，通過(guò)門靜脈途徑移植入大鼠體內(nèi)，同時(shí)建立空白對(duì)照組；分別于移植后1天、1周、2周、3周及4周時(shí)，取肝組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)及組織鐵染色，觀察隨時(shí)間推移，移植的HMSCs在大鼠肝臟遷移存活情況。 結(jié)果顯示利用CCl4皮下注射方法，持續(xù)8周后，大鼠逐漸消瘦，毛發(fā)無(wú)光澤，稀少，肝臟邊緣變鈍、萎縮，質(zhì)地變硬，

7、肝表面出現(xiàn)顆粒狀改變。石蠟切片HE染色可見(jiàn)肝細(xì)胞條索紊亂，并出現(xiàn)脂肪樣空泡及假小葉形成。Feridex標(biāo)記的HMSCs在經(jīng)門靜脈移植后1天后，大鼠肝組織切片可見(jiàn)普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞主要沿匯管區(qū)及其周圍肝竇分布；移植后1周大鼠肝組織中，在增生的纖維組織及肝小葉中可見(jiàn)普魯士蘭染色陽(yáng)性細(xì)胞；移植后2周的大鼠肝組織中，小葉內(nèi)普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞較前增多；移植后3周肝組織普魯士藍(lán)染色，提示增生的纖維組織及小葉中陽(yáng)性細(xì)胞逐漸減少；移植后4周的肝組織

8、，已很難見(jiàn)到有藍(lán)染顆粒的細(xì)胞存在?？瞻捉M中各時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)普魯士藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞。HMSCs移植后第1天的肝臟組織中免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于肝內(nèi)匯管區(qū)及匯管區(qū)周圍的肝竇中；移植后1周，肝組織免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞仍較多分布于匯管區(qū)，并出現(xiàn)于增生的纖維組織及肝小葉中；移植后2周，小葉內(nèi)免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞較前增多；移植后第3～4周，組織切片提示免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞在增生的纖維組織及肝小葉中未見(jiàn)減少。而空白組各個(gè)時(shí)間跨度的肝臟組織切片中，均未發(fā)現(xiàn)免疫組化