大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的磁性標(biāo)記及磁共振活體示蹤研究.pdf

1、背景： 利用干細(xì)胞(stem cell，SC)治療各種組織壞損或退化性疾病是我國(guó)“十五”、“十一五”期間的科技主攻方向之一，也是國(guó)際上的研究熱點(diǎn)，美國(guó)《科學(xué)》雜志將干細(xì)胞研究評(píng)為1999年世界十大科學(xué)成就之榜首。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，MSCs)是干細(xì)胞最重要的一種，它具有多項(xiàng)分化的特點(diǎn)，可分化為其他類型組織細(xì)胞，且來(lái)源相對(duì)廣泛，不涉及倫理問題，因此MSCs在神經(jīng)、心臟、肝臟等諸多器官疾病

2、方面的應(yīng)用潛能受到越來(lái)越多的重視。 在肝臟疾病方面，Lee K D等用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子與致瘤素M通過兩步法在體外有效地誘導(dǎo)MSCs向肝細(xì)胞分化，4周后，被誘導(dǎo)的細(xì)胞在形態(tài)和分子標(biāo)記物上都具有肝細(xì)胞特征。Terai等將綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨髓細(xì)胞從尾靜脈注入到四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠體內(nèi)，結(jié)果提示：在肝損傷微環(huán)境下骨髓細(xì)胞可以體內(nèi)轉(zhuǎn)化成肝細(xì)胞。國(guó)內(nèi)北京軍區(qū)總醫(yī)院首先將自體骨髓干細(xì)胞用于40余例重型肝炎和肝硬化患者的治療，

3、取得初步的臨床療效。中山三院肝臟疾病研究實(shí)驗(yàn)室在“干細(xì)胞修復(fù)肝臟工程”的系列研究中，自2003年開始，進(jìn)行了大量正常成人和30余例肝病患者M(jìn)SCs的培養(yǎng)并對(duì)其各項(xiàng)生物學(xué)特性進(jìn)行了深入的研究，并于2005年試探性地在臨床對(duì)25例晚期肝病志愿者開展經(jīng)肝動(dòng)脈途徑自體MSCs移植治療，并取得了明確療效：患者總膽紅素水平在移植治療4周內(nèi)下降者達(dá)到73.5％，凝血功能在移植治療4周內(nèi)好轉(zhuǎn)者達(dá)到84.6％。 然而，令人鼓舞地臨床、實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻缺

4、乏客觀的MSCs生長(zhǎng)分化證據(jù)的支持，MSCs在體內(nèi)的向肝細(xì)胞分化的能力和定居、定位情況尚不十分明確，使植入MSCs在肝臟損傷修復(fù)中到底發(fā)揮了多大作用難以正確評(píng)價(jià)。Weissleder于1999年提出分子影像學(xué)的概念后，利用分子影像學(xué)的方法對(duì)移植MSCs進(jìn)行監(jiān)測(cè)成為研究的熱點(diǎn)，本文即是通過多聚賴氨酸(PLL)介導(dǎo)的氧化鐵納米顆粒(SPIO)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，經(jīng)盲腸靜脈移植入肝纖維化大鼠，利用MR成像技術(shù)對(duì)其進(jìn)行活體示蹤，描

5、述其成像特點(diǎn)，并評(píng)價(jià)PLL-SPIO對(duì)干細(xì)胞的標(biāo)記及活體示蹤效果，為進(jìn)一步研究干細(xì)胞活體內(nèi)增殖、分化提供影像學(xué)的支持。 目的： 提取、分離并培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，探討SPIO(商品名Resovist，Schering公司)標(biāo)記MSCs的方法、濃度，比較不同濃度SPIO的轉(zhuǎn)染率及對(duì)MSCs的生長(zhǎng)、增殖的影響，描述SPIO標(biāo)記的MSCs體外及活體成像特點(diǎn)，并評(píng)價(jià)PLL-SPIO對(duì)干細(xì)胞的標(biāo)記及活體示蹤效果。

6、 方法： 1.分別采用貼壁法和貼壁法+percoll密度離心法獲取MSCs，體外傳代、培養(yǎng)、純化并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45、CD29、CD44、CD11b，比較2種方法的優(yōu)劣。 2.檢測(cè)獲取的：MSCs性能：MTT測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst 33258檢測(cè)凋亡。 3.分別采用鐵濃度為25μg/ml及50μ/ml SPIO-PLL標(biāo)記MSCs，電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒，普魯士藍(lán)染色

7、顯示細(xì)胞內(nèi)鐵，分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鐵含量；評(píng)價(jià)2種濃度SPIO-PLL標(biāo)記MSCs后，對(duì)其生長(zhǎng)及增殖的影響(MTT、細(xì)胞活力、凋亡)。 4.用鐵濃度為25μg/ml及50μg/ml的SPIO-PLL標(biāo)記MSCs,對(duì)不同數(shù)量級(jí)的細(xì)胞行MR掃描，掃描序列為：SE序列T1WI，快速自旋回波(FSE)序列T2WI，梯度回波序列(GRE)T2*WI。 5.建立慢性肝纖維化大鼠模型，分為A、B、C三組，分別經(jīng)盲腸靜脈移植標(biāo)記MSCs

8、(4×106個(gè)/2ml)、SPIO2ul(Fe濃度28mg/ml)、未標(biāo)記MSCs(4×106個(gè)/2ml)，并于移植前、移植后1小時(shí)、24小時(shí)及移植后3、5、7、10、12、15天行MR檢查，測(cè)量肝臟信噪比(signal-to-noise ratio，SNR)，在信號(hào)消失后處死大鼠，取肝臟標(biāo)本行HE及普魯士藍(lán)染色。 結(jié)果： 1.MSCs接種24h后可見細(xì)胞貼壁，先為單個(gè)圓形細(xì)胞，后伸展為三角形、多角形，并逐漸變成梭形，約

9、7-10天長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。用貼壁篩選法獲得的MSCs接種24h后可見大量的造血干細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，隨著換液及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，造血干細(xì)胞被去掉使MSCs得以純化，而用密度梯度離心法獲得的細(xì)胞則含有很少的造血干細(xì)胞，細(xì)胞純化效果好；流式細(xì)胞儀檢查表型的結(jié)果也顯示密度梯度離心法獲得的細(xì)胞較單純貼壁法獲得的MSCs純度高。 2.鐵濃度25ug/ml細(xì)胞內(nèi)鐵含量為10.95±5.13pg/cell，標(biāo)記MSCs存活率為98.1％±0.04，

10、標(biāo)記率為97±1％。鐵濃度50ug/ml細(xì)胞內(nèi)鐵含量為14.22±7.41pg/cell，標(biāo)記MSCs存活率為97.9％±0.04，標(biāo)記率為100％。兩組間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。 3.體外MR成像顯示：T2*WT序列對(duì)標(biāo)記MSCs的信號(hào)變化最敏感，且隨著細(xì)胞數(shù)量級(jí)增大，信號(hào)變化逐漸明顯，顯示信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量級(jí)間存在相關(guān)性。 4.標(biāo)記MSCs組(A組)：與移植前比較，移植后肝臟信號(hào)在T1WI、T2WI、T2*WI序

11、列上均明顯降低，以T2*WI最明顯，此后信號(hào)降低程度逐漸減弱，SNR值逐漸升高，至15天與移植前相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.650,P>0.05)。 注射SPIO組(B組)：移植后肝臟信號(hào)亦明顯減低，但信號(hào)恢復(fù)較快，至移植后第3天，SNR值與移植前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.550，P>0.05)。 未標(biāo)記MSCs組(C組)：與移植前比較，移植后各時(shí)間點(diǎn)SNR值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.871，P>0.05)。

12、 標(biāo)記MSCs組(A組)、注射SPIO組(B組)與未標(biāo)記MSCs組(C組)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.693、2.964，P<0.05)。 注射標(biāo)記MSCs或SPIO與觀察時(shí)間之間存在交互作用(F=4.972，P<0.05)：標(biāo)記MSCs組(A組)與注射SPIO組(B組)之間肝臟SNR隨時(shí)問變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.346，P<0.05)。 MSCs移植后肝臟普魯士藍(lán)染色可見藍(lán)染細(xì)胞主要分布在肝小葉間

13、隔，隨時(shí)問推移，細(xì)胞數(shù)逐漸減少，但是部分細(xì)胞逐漸由肝小葉間隔遷移至肝實(shí)質(zhì)。 結(jié)論： 1、貼壁法+密度梯度離心法是骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞分離純化的較好方法，其獲得的MSCs較單純貼壁法純度明顯高。 2、Fe濃度為25ug/ml、50ug/ml的SPIO-PLL標(biāo)記MSCs，對(duì)其分裂、增殖均無(wú)影響，標(biāo)記率分別為97±1％、100％，細(xì)胞內(nèi)鐵含量為10.95±5.13pg/cell、14.22±7.41pg/cell，均可滿

14、足MSCs磁共振示蹤的要求。 3、標(biāo)記細(xì)胞體外成像以T2*WI序列最為敏感，信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量級(jí)間存在相關(guān)性。 4、腹腔注射CCl4和橄欖油混合液(1：5)可以獲得滿意的大鼠肝纖維化模型，且肝纖維化的程度與注射的時(shí)間長(zhǎng)度直接相關(guān)，有利于控制。 5、盲腸靜脈-門靜脈途徑為MSCs肝臟移植的一條較理想入路，操作簡(jiǎn)單，出血少，穿刺成功率高，大鼠死亡率低。 6、SPIO-PLL標(biāo)記MSCs后，利用MR可對(duì)其進(jìn)行短期活