Feridex標(biāo)記BMSCs經(jīng)尾靜脈注射移植治療MCAO大鼠及MRI示蹤的實驗研究.pdf

1、腦血管病已經(jīng)成為人類致死致殘最主要的原因之一，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢，其中以缺血性腦卒中最常見。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)和分離成功打破了神經(jīng)組織損傷不能再生的傳統(tǒng)觀念。目前國內(nèi)外相關(guān)研究大多將骨髓基質(zhì)細胞直接移植到腦缺血區(qū)域，獲得了令人振奮的治療效果。通過立體定向或者開顱直接注射入損傷部位或者直接注射入腦室腦池，能將BMSCs直接送達受損部位，提高移植物抵達靶點的數(shù)量。因開創(chuàng)性手術(shù)對腦組織產(chǎn)生一定的損傷；不便多次多靶點注射；同時也存在無菌性蛛

2、網(wǎng)膜炎和蛛網(wǎng)膜下腔粘連的危險。本研究選擇經(jīng)尾靜脈注入骨髓基質(zhì)細胞，簡便、安全、快捷，一次可以輸入較多數(shù)量的BMSCs，進入腦內(nèi)的BMSCs分布在缺血壞死灶周邊區(qū)。本研究主要解決的問題是BMSCs經(jīng)尾靜脈注射移植后，如何在活體內(nèi)檢測移植細胞的定向歸巢和細胞增殖。本研究方法是使用活體示蹤劑超順磁性氧化鐵顆粒Feridex（商品名：菲立磁）在磁共振下體內(nèi)外觀察被標(biāo)記的BMSCs，監(jiān)測BMSCs在腦內(nèi)存活、增殖和向神經(jīng)分化，分析對MCAO大鼠的

3、神經(jīng)功能評分改變的影響，評價經(jīng)靜脈注射移植BMSCs以及Feridex標(biāo)記BMSCs的可行性。 第一部分 大鼠骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)實驗研究 目的：探索大鼠骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的體外培養(yǎng)方法。 方法：體外分離60～90 g SD（Sprague—Dawley）大鼠骨髓，貼壁法擴增培養(yǎng)大鼠BMSCs，相差顯微鏡觀察原代及不同傳代細胞的生長特性及形態(tài)變化，并進

4、行細胞表型鑒定和巢蛋白（nestin）、神經(jīng)元特異性核蛋白（Neuronal specific neucleoprotein，NeuN）、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）免疫細胞化學(xué)鑒定。 結(jié)果：培養(yǎng)的BMSCs傳代12小時后貼壁率高達95%，在第3代純度可達到92%。大鼠BMSCs經(jīng)分離純化并傳代后能表達nestin、NeuN、GFAP等特異性標(biāo)記物，傳到第3代后鏡

5、下nestin陽性細胞率為80.1%，GFAP陽性細胞率為28.7%，NeuN陽性細胞率為14.5%。 結(jié)論：傳3代的細胞可作為理想細胞移植治療的細胞來源。 第二部分 Feridex標(biāo)記骨髓基質(zhì)細胞體外實驗研究 目的：應(yīng)用超順磁性氧化鐵Feridex和陽離子轉(zhuǎn)染試劑多聚賴氨酸（PLL）復(fù)合物Feridex—PLL體外標(biāo)記大鼠骨髓基質(zhì)細胞（BMSCs），初步評價磁共振成像示蹤Feridex標(biāo)記BMSCs的可行性。

6、 方法：體外分離60～90 g SD大鼠骨髓，貼壁法擴增培養(yǎng)大鼠BMSCs，并用Feridex—PLL體外標(biāo)記，用普魯士藍染色和臺盼蘭排斥試驗鑒定細胞內(nèi)鐵以及標(biāo)記細胞的活性；利用MRI不同序列快速自旋回波（TSE）脈沖序列TSE—T1WI、TSE—T2WI、FFE—T2WI分別對Feridex—PLL標(biāo)記后BMSCs和未標(biāo)記BMSCs按1×105、5×105、6×105不同細胞數(shù)量進行成像，分析其信號強度值和強度變化率（ASI）與

7、不同序列、標(biāo)記情況和標(biāo)記細胞數(shù)量的關(guān)系。 結(jié)果：Feridex—PLL對BMSCs體外標(biāo)記率近100%，對細胞形態(tài)和活性無明顯影響。未標(biāo)記細胞在TSE—T1WI、TSE—T2WI與FFE—T2WI之間的信號強度無統(tǒng)計學(xué)差異。細胞標(biāo)記與不標(biāo)記間的MRI各序列信號強度之間差異顯著（P<0.001），前者隨著細胞數(shù)量的增加而增強。各序列信號強度測量值在細胞是否標(biāo)記與標(biāo)記細胞數(shù)量之間交互效應(yīng)較大。3個序列中以FFE—T2WI的信號強度變

8、化率（ASI）最大，對磁標(biāo)記細胞的顯示最為敏感。在各成像序列上不同標(biāo)記數(shù)量的細胞與未標(biāo)記細胞之間的信號強度顯示明顯的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.001）。各序列ASI在細胞是否標(biāo)記與標(biāo)記細胞數(shù)量之間有較小的交互效應(yīng)。 結(jié)論：MRI成像顯示標(biāo)記后1×105個細胞即可引起明顯的信號改變，F(xiàn)FE—T2WI序列最為敏感，信號強度與細胞數(shù)量明顯相關(guān)，非常適用于BMSCs體內(nèi)外的示蹤研究。Feridex—PLL是BMSCs比較理想的示蹤劑，標(biāo)記率高

9、。 第三部分 線栓法制備MCAO大鼠模型 目的：用線栓法制作SD大鼠大腦中動脈梗塞（MCAO）模型，方法簡單、易行、梗塞范圍恒定、模型穩(wěn)定。 方法：選用健康、成年雄性清潔級SD大鼠100只，用線栓法堵塞大腦中動脈2h，再灌注后3d內(nèi)Zea—Longa評分2～3分為成功模型。模型制造后3d、7d通過神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評分（modified Neurological Severity Scores，NSS）和橫木行走實

10、驗（Beam walking Test，BWT）評分觀察其行為學(xué)改變，同時行MRI檢查了解各序列梗塞病灶變化情況，再灌注后7d斷頭取腦，進行TTC染色及HE染色觀察梗塞情況。 結(jié)果：技術(shù)未成熟時模型制備再灌注24小時內(nèi)模型成功率為52%，3日內(nèi)模型成功率為35%。后期模型制備的28只老鼠3日內(nèi)成功率75%，死亡率和失敗率均低。35只成功大鼠模型的行為學(xué)評分：缺血再灌注后3天NSS7.63±2.613分，7天NSS6.97±2.7

11、60分，二者的有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.006）；缺血再灌注后3天BWT評分5.23±1.864分，7天BWT5.03±2.062分，二者無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.393）。成功模型MRI掃描可見大鼠腦組織水腫明顯，T2WI示顯著高信號，一周時水腫達高峰期；動態(tài)觀察水腫程度隨時間呈不同程度緩解；T2WI信號遞減，以梗塞周邊區(qū)明顯。TTC染色見梗塞病灶范圍基本恒定。 結(jié)論：技術(shù)成熟后，線栓法可制備穩(wěn)定的MCAO大鼠模型，能作為腦梗塞

12、實驗研究的模型。 第四部分 Feridex標(biāo)記BMSCs經(jīng)尾靜脈注射移植治療MCAO大鼠及MRI示蹤 目的：評估核磁共振示蹤觀察Feridex標(biāo)記移植后BMSCs存活、定向歸巢能力和分化的效果。 方法：選用健康、成年雄性清潔級SD大鼠100只，隨機分成經(jīng)尾靜脈注射移植治療組（SPIO—BrdU—BMSCs移植組，細胞數(shù)3×106，20只）、梗塞對照組（梗塞后SPIO—PLL單獨注射，20只）、假手術(shù)移植組（SPI

13、O—BrdU—BMSCs移植，細胞數(shù)3×106，20只）、空白對照組（正常大鼠經(jīng)尾靜脈注射等容量PBS，20只）、經(jīng)頸動脈注射移植治療組（SPIO—BrdU—BMSCs移植組，細胞數(shù)2×106，20只）。缺血再灌注后7d經(jīng)靜脈或者動脈注射，按注射后處死時間3d、7d、14d、28d分成亞組，每亞組均為5只大鼠。經(jīng)尾靜脈或者頸動脈注射移植Feridex—PLL和5—溴脫氧尿核苷（5—bromodeoxyuridine，BrdU）雙標(biāo)記的B

14、MSCs或者經(jīng)尾靜脈注射Feridex—PLL、PBS，在各時相點分別進行大鼠行為學(xué)評分、MRI各序列信號觀察、取腦組織石蠟切片后進行普魯士藍染色及免疫組化染色、免疫雙標(biāo)共聚焦觀測。 結(jié)果：經(jīng)尾靜脈細胞移植后MCAO大鼠的神經(jīng)功能評分NSS、BWT在28d時較梗塞對照組有所提高（P<0.05），改善程度稍小于經(jīng)頸動脈移植組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。靜脈移植組普魯士藍染色的陽性細胞基本在梗塞邊緣較密集分布，MRI顯示MCA

15、O大鼠腦內(nèi)梗塞灶周圍環(huán)形或片狀T2WI和FFE—T2WI明顯低信號；經(jīng)頸動脈移植對照組的MCAO大鼠普魯士藍染色可見梗塞側(cè)彌散分布較多的陽性細胞，MRI顯示梗塞側(cè)彌散低信號；與兩組的免疫組化結(jié)果相吻合。結(jié)論：經(jīng)尾靜脈注射移植BMSCs可改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能損害。Feridex可以用于BMSCs移植的活體示蹤。 結(jié)論： 1.體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，增殖迅速，易篩選，傳3代的細胞可作為腦血管疾病干細胞移植治療理想的細胞來

16、源。 2.線栓法制作MCAO大鼠模型具有較穩(wěn)定的缺血范圍和較高的成功率，是腦梗塞研究較為穩(wěn)定的動物模型。 3.Feridex可以在體外成功標(biāo)記BMSCs，MRI各脈沖序列顯示信號佳，F(xiàn)FE—T2WI對其磁效應(yīng)尤為敏感，信號強度與標(biāo)記細胞數(shù)量呈明顯的負相關(guān)。 4.移植的BMSCs能在腦梗塞大鼠腦內(nèi)存活、趨向梗塞區(qū)，并能向神經(jīng)細胞方向分化。 5.經(jīng)尾靜脈注射移植BMSCs可改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能缺損。