體外三維環(huán)境下骨髓間充質干細胞誘導分化為肝細胞及其極化特征.pdf

1、研究背景和目的：
　　 終末期慢性肝病，尤其是急性肝功能衰竭，發(fā)病率及死亡率均較高。肝移植是目前確實有效的治療手段，但由于供體器官的缺乏，僅少于30％的肝病患者可獲得肝移植。肝細胞治療可作為肝移植的替代輔助治療，然而其局限性在于人肝細胞來源缺乏。骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSC)在體外肝細胞生長因子等刺激作用下可分化為具有合成和分泌白蛋白及多種肝細胞代謝產物的肝細胞樣細胞，可作為

2、肝細胞治療的新細胞來源。以往研究多采用平面二維細胞培養(yǎng)體系，誘導分化細胞呈單層生長，與體內細胞生理環(huán)境所處的三維環(huán)境顯著不同。近年來，細胞三維培養(yǎng)方式逐漸應用于組織再生和腫瘤侵襲等領域，Ⅰ型鼠尾膠原蛋白可模擬體內細胞生長所需的細胞外基質，是最常用的三維細胞誘導體系。已有報道胚胎干細胞在膠原蛋白三維誘導體系下可分化為體內多種胚胎樣組織結構，為未來器官再生研究奠定基礎。肝細胞是體內高度極化的細胞。肝細胞的極化特征對于肝細胞發(fā)揮正常功能至關重

3、要。成人BMSC在三維培養(yǎng)體系中能否完成向肝細胞分化，并形成肝細胞特征性的極化結構，目前尚未可知。本研究應用膠原蛋白三維培養(yǎng)體系將成人骨髓間充質干細胞體外誘導分化為肝細胞，并以此為模型，深入研究肝細胞極化產生的分子基礎和形態(tài)、功能特征，探討肝細胞極化形成所需的細胞外基質條件及主要影響因素，為臨床治療由肝細胞極化紊亂引發(fā)的各種肝病提供理論基礎。
　　 實驗方法：
　　 一．從成人骨髓中分離出BMSC，同時利用普通平面二維細

4、胞培養(yǎng)和膠原蛋白三維培養(yǎng)體系進行體外誘導分化培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察平面培養(yǎng)體系下誘導分化來源的肝細胞在不同時期的形態(tài)學變化。用HE染色法觀察三維培養(yǎng)條件下分化肝細胞的形態(tài)及結構特征。用免疫熒光法觀察肝細胞特異性蛋白ALB在平面培養(yǎng)分化來源肝細胞的特征性表達。用免疫組化法檢測肝細胞特異性蛋白ALB和AFP在膠原蛋白三維誘導分化來源肝細胞的特征性表達來證實成人骨髓基質干細胞在體外誘導分化過程中肝細胞特異性標志物產生。
　　 二．用免

5、疫熒光染色方法分別觀察SRBI和BSEP等極化標志性蛋白在BMSC二維誘導分化來源肝細胞和膠原蛋白三維誘導分化來源肝細胞的特征性表達，是否形成特征性的極化結構及膽管樣結構，應用小鼠肝原代細胞“三明治”培養(yǎng)極化模型作為陽性對照。
　　 研究結果：
　　 一．和以往研究結果一致，成人骨髓基質干細胞經平面培養(yǎng)誘導分化后形成成熟肝細胞特征性的多邊形，方形等形態(tài)。免疫熒光染色顯示在分化成熟21天后可見肝細胞特異性蛋白ALB在誘導分

6、化來源肝細胞胞質內陽性表達。BMSC在體外膠原蛋白三維培養(yǎng)誘導分化體系后細胞同樣具有成熟肝細胞的形態(tài)。HE染色結果顯示細胞在三維培養(yǎng)體系內呈多層排列生長，形成細胞間緊密連接及管狀結構。免疫組化染色結果顯示BMSC誘導分化來源肝細胞可表達特異性蛋白ALB和AFP。
　　 二．BMSC在平面培養(yǎng)誘導作用下可特異的表達肝細胞極化蛋白BSEP和SRBI，但未能形成明確的特征性極化結構及膽管結構。BMSC在體外膠原蛋白三維培養(yǎng)誘導分化體系

7、下不僅可特異表達肝細胞極化蛋白BSEP和SRBI，且在三維結構中可見相鄰細胞形成緊密連接，從而形成特征性的極化結構和膽管結構。SRBI定位分布于面向毛細血管的基底膜面，而BSEP主要分布于面向毛細膽管的頂膜，相互連接形成特征性的毛細膽管結構，于小鼠肝原代細胞類似。
　　 研究結論：
　　 一．通過本研究，我們發(fā)現，體外三維培養(yǎng)誘導分化體系作用下BMSC可分化為成熟肝細胞，細胞在三維結構內早期即形成多層整齊排列，易形成球狀