CLDN1基因?qū)κ彻荀[癌細(xì)胞失巢凋亡的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究目的：探討 CLDN1基因在食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡中的作用及分子機(jī)制。
　　方法：通過體外細(xì)胞培養(yǎng)正常食管上皮細(xì)胞（HEEC）、Eca109、Eca9706、TE1、TE10、TE11、Kyse150細(xì)胞系，使用qRT-PCR篩選出低表達(dá)及高表達(dá)CLDN1 mRNA的食管鱗癌細(xì)胞株作為沉默及過表達(dá) CLDN1基因的實驗對象（TE11及TE10細(xì)胞）；體外構(gòu)建含有GFP-Puro-sh-CLDN1序列的慢病毒及含有GFP-Puro

2、-CLDN1序列慢病毒載體轉(zhuǎn)染TE11及TE10細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72小時后，使用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，獲得穩(wěn)定低表達(dá)（sh-CLDN1組）及高表達(dá)CLDN1（CLDN1組）細(xì)胞株。Western blot技術(shù)檢測CLDN1沉默及過表達(dá)效果；通過流式細(xì)胞儀檢測篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。懸浮培養(yǎng)篩選后的細(xì)胞株，使用流式細(xì)胞儀檢測失巢凋亡率，觀察CLDN1的表達(dá)與細(xì)胞失巢凋亡的關(guān)系。利用Lv-GFP-RFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染篩選的食管鱗癌細(xì)胞，在激光共聚

3、焦顯微鏡觀察下觀察CLDN1表達(dá)對細(xì)胞自噬影響，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測LC3B、p62蛋白及自噬相關(guān)通路p-AMPKα、ULK1相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。使用 AMPK通路激動劑二甲雙胍激活 p-AMPKα后使用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測（sh-CLDN1+MET組）CLDN1、AMPKα、ULK1、LC3B蛋白質(zhì)的表達(dá)變化情況。使用自噬抑制劑三甲基腺嘌呤(3-methyladenine)及激動劑雷帕霉素（Rapamycin）分別處理的篩選

4、的 CLDN1組及 sh-CLDN1組食管鱗癌細(xì)胞獲得（CLDN1+3MA組，sh-CLDN1+RAPA組）細(xì)胞并與處理前的細(xì)胞比較失巢凋亡率變化，觀察自噬與失巢凋亡的調(diào)控關(guān)系。動物水平上，通過裸鼠皮下荷瘤實驗驗證CLDN1對食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡影響。
　　結(jié)果：體外成功篩選出穩(wěn)定干擾CLDN1及過表達(dá)CLDN1的細(xì)胞。Western bolt檢測發(fā)現(xiàn)：沉默組（sh-CLDN1組）CLDN1的表達(dá)與NC組相比下調(diào)（0.275±0.

5、046比0.691±0.031,P<0.05），過表達(dá)組(CLDN1組）CLDN1的表達(dá)與NC組相比上調(diào)（0.706±0.086比0.191±0.051,P<0.05）。干擾組失巢凋亡率較對照組明顯升高（38.901±2.541％比19.882±3.568%，P<0.05）。過表達(dá)組失巢凋亡率較對照組下降（17.170±2.122%比39.121±3.281%， P<0.05）。結(jié)果表明干擾CLDN1的表達(dá)可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡，過

6、表達(dá)CLDN1的表達(dá)可抑制食管鱗癌細(xì)胞失巢凋亡。激光共聚焦顯微鏡觀察統(tǒng)計自噬小體顯示：下調(diào)CLDN1能夠抑制細(xì)胞自噬（5.671±1.267比11.50±1.50，P<0.05），上調(diào) CLDN1能夠促進(jìn)自噬（22.670±2.510比5.671±0.580，P<0.05）。自噬抑制劑3-MA抑制自噬后可增加過表達(dá)組失巢凋亡率（CLDN1組：6.505±2.104%比 CLDN1+3MA組：16.684±2.337%， P<0.05），

7、自噬激動劑雷帕霉素促進(jìn)自噬后降低干擾組（sh-CLDN1組）的失巢凋亡率（sh-CLDN1組：42.035±3.092%比sh-CLDN1+RAPA組：25.984±3.356%，P<0.05）。細(xì)胞及動物組織中 Western blot顯示干擾 CLDN1引起p-AMPKα和ULK1表達(dá)下調(diào)，LC3BII/LC3BI比值降低（0.590±0.036、0.59±0.05，0.627±0.150，P<0.05）；反之則升高。使用二甲雙胍激