斑馬魚多聚免疫球蛋白受體（zplgR）基因的克隆.pdf

1、多聚免疫球蛋白受體是介導(dǎo)多聚免疫球蛋白(包括IgA和少量IgM)通過粘膜上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運的一種Ⅰ型跨膜糖蛋白,其基因已在多種哺乳動物中克隆.本研究通過分子克隆、基因重組技術(shù),在體外將斑馬魚多聚免疫球蛋白受體(zpIgR)蛋白)的部分編碼基因zpIgR連接到pET-28a(+)表達(dá)載體上,而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),使其表達(dá)外源蛋白zpIgR,進而利用表達(dá)的外源蛋白制備抗原,免疫動物,得到抗血清,利用免疫組化的方法確定zpIgR的組

2、織中的定位. 本實驗首先以斑馬魚內(nèi)臟為材料,利用zpIgR法提取斑馬魚內(nèi)臟總RNA,用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈,并以其為模板利用RT-PCR.擴增得到zpIgR蛋白的部分編碼基因zpIgR,經(jīng)EeoRI、BamHI雙酶切后將其連接入pET-28a(+)表達(dá)載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,并對重組子進行雙酶切鑒定、PCR鑒定以及序列測定.重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切,得到兩條片段,片段大小分別對應(yīng)pET-28a(

3、+)質(zhì)粒以及PCR.擴增產(chǎn)物.重組質(zhì)粒進一步測序,結(jié)果顯示的堿基序列與GenBank中電子克隆的堿基序列基本一致. 將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3),用lmM的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),并對蛋白在菌體內(nèi)的表達(dá)形式進行分析.SDS-PAGE結(jié)果顯示,與對照菌相比,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌在分子量為30.75KDa處有蛋白表達(dá).進一步實驗分析表明,在37℃條件下經(jīng)lmM IPTG誘導(dǎo)4h時蛋白表達(dá)量最大,并且表達(dá)的

4、蛋白大部分是以包涵體的形式存在的. 用2M尿素對包涵體蛋白進行初步洗滌后,經(jīng)PBS透析、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒定量后,用30﹪的PEG8000濃縮至適當(dāng)濃度,制備抗原免疫動物,收獲抗血清,并利用得到的抗血清進行瓊脂雙向擴散以及蛋白質(zhì)印跡.經(jīng)瓊脂雙向擴散測得抗血清的效價為1:32;蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果顯示,在PVDF膜上特異性的顯示出了分子量為30.75KDa的蛋白條帶. 綜上所述,利用RT-PCR方法克隆到zpIgR部分編