殺傷細胞免疫球蛋白樣受體基因與艾滋病疾病進程關(guān)系的研究.pdf

1、目的:國外研究報道顯示自然殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)可能是影響HIV（HIV）感染后疾病進程的重要因素之一。KIR是NK細胞表面一類重要的識別受體，在NK細胞識別“自己”與“非己”及殺傷功能的調(diào)節(jié)中起著極其重要的作用，其配體為人類白細胞抗原(HLA)Ⅰ類分子。KIR及HLA基因復(fù)合體都具有高度的多態(tài)性，國外對不同人群KIR基因多態(tài)性與HIV的易感性、HIV感染后疾病進展的相關(guān)性研究結(jié)果不盡相同。在DNA研究層面，有研究發(fā)現(xiàn)活化性

2、基因KIR3DS1與HLA-Bw4-80He聯(lián)合表達與延緩疾病進展相關(guān)；還有研究發(fā)現(xiàn)HLA-Bw4純合子與延緩疾病進展和維持正常水平的CD4+T細胞顯著正相關(guān)。在RNA研究層面，有文獻報道高水平的猴免疫缺陷病毒(SIV)的復(fù)制與增長的KIR3DLl mRNA表達水平正相關(guān)；其他學(xué)者認為，在急性HIV感染時，活化性KIR的mRNA水平增高，而在慢性HIV感染時，抑制性KIR的mRNA增高。中國人群的遺傳背景不同于國外人群，對中國HIV感染

3、者KIR的DNA定性研究未見報道，尤其是對中國HIV感染者長期不進展(LTNP)人群KIR3DS1和KIR3DL1表達水平的研究尚未見報道。本研究選取長期不進展者(LTNP)和典型進展者(TP)，分析他們的KIR基因多態(tài)性與艾滋病疾病進展的關(guān)系以及KIR的表達水平與疾病進程的關(guān)系，這對于預(yù)測艾滋病疾病進程，尋找有效的HIV防治方法提供了新思路。
　　 材料和方法:
　　 一、研究對象
　　 收集我國HIV血清抗體

4、陽性者132例，所有病例均為漢族，根據(jù)疾病進展程度分為長期不進展組和典型進展組。其中長期不進展者(LTNP)組43例，入選標準為感染HIV的時間≥10年，未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)，連續(xù)三次（時間間隔為6個月），CD4+T細胞數(shù)量均在500cells/μl以上。典型進展者(TP)組89例，入選標準為CD4+T細胞數(shù)＜500cells/μl和/或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病。根據(jù)病毒載量將感染者分為兩組：高病毒載量組51例，病毒載量≥10

5、4 copies/ml，低病毒載量組51例，病毒載量＜104 copies/ml。根據(jù)CD4+T細胞計數(shù)分為兩組：即CD4+T細胞數(shù)≥500cells/μl組66例，CD4+T細胞數(shù)＜500cells/μl組36例。正常人選自HIV陰性的體檢人群，其血常規(guī)、肝炎八項、梅毒、HIV初篩等均為陰性。所有研究對象在抽血留樣前均簽署知情同意書并進行了相關(guān)問卷調(diào)查。
　　 二、實驗方法
　　 （一）等位基因分型檢測及測序
　

6、　 1、DNA提取及KIR等位基因分型檢測
　　 使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取全基因組DNA。標本為1ml EDTA抗凝外周靜脈血，按照試劑盒說明書標準方法快速提取全基因組DNA。KIR分型采用PCR-SSP方法，使用KIR Genotyping SSP Kit檢測。根據(jù)產(chǎn)物有無及片段的大小，對照工作表確定KIR基因型。
　　 2、 HLA-B基因分型檢測及HLA-B核苷酸及氨基酸序列特征

7、分析采用PCR-SSP方法，以全基因組DNA為模板，以Bx1和BIiN T3為引物進行PCR擴增。以BEX2F為測序引物進行測序。使用BioEdit軟件包中CLUSTAL W程序，對我國HIV-1感染者的HLA-B基因序列與參考株序列進行排列和比較。將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，根據(jù)HLA-B基因第二外顯子C-末端80-83位所編碼氨基酸序列的差異，判斷其血清型。
　　 （二）CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)和病毒載量檢測
　　

8、 應(yīng)用流式細胞儀，F(xiàn)ACS MULTISET軟件檢測外周全血并進行自動分析，計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細胞絕對值及相應(yīng)比值等。取感染者血漿1ml，使用美國Roche公司的TAGMAN AMPLICOR自動載量儀測定病毒載量。
　　 （三）實時定量PCR檢測mRNA水平
　　 獲取外周血單個核細胞后提取RNA。用TA克隆法制備實時定量PCR檢測的標準品。采用相對定量標準曲線法，用染料SYBR Green來檢測

9、KIR3DS1，KIR3DL1和TNF-α的mRNA表達水平。
　　 三、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，基因出現(xiàn)頻率通過直接計數(shù)測得，比較組間差異進行χ2檢驗并計算P值或雙尾Fisher's精確概率檢驗。用非參數(shù)檢驗分析各組基因表達水平的不同，并計算P值。以P＜0.05，認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果:
　　 一、與HIV-1感染者疾病進程相關(guān)的KIR位點等位基因
　　

10、 1、TP組和LTNP組的KIR2DS3等位基因頻率分別為13.5％和34.9％，兩組的KIR2DS3等位基因頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異，KIR3DS1等位基因頻率分別為24.7％和48.8％，兩組的KIR3DS1等位基因頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2、高病毒載量組和低病毒載量組KIR基因頻率的比較：高病毒載量組和低病毒載量組的KIR2DS5等位基因頻率分別為7.84％和43.1％，兩組的KIR_2DS5等位基因頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。KI

11、R3DS1等位基因頻率分別為21.6％和43.2％，兩組的KIR3DS1等位基因頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3、根據(jù)CD4′T細胞計數(shù)的不同對KIR的基因頻率進行分析：CD4+T細胞數(shù)≥500cells/μ1組和CD4+T細胞數(shù)＜500cells/μ1組的KIR2DS5等位基因頻率分別為33.3％和11.1％，兩組的KIR2DS5等位基因頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。兩組KIR3DS1等位基因頻率分別為40.9％和16.7％，兩組的KIR

12、3DS1等位基因頻率也同樣具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 二、與HIV-1感染者疾病進程相關(guān)的HLA-B位點等位基因
　　 1、TP組和LTNP組的HLA-Bw6純合子頻率分別為3626和11.6％，TP組明顯高于LTNP組，兩組的HLA-Bw6純合子頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。TP組和LTNP組帶有Bw4-80I的個體頻率分別為11.2％和37.2％，TP組明顯低于LTNP組，兩組帶有Bw4-80I的個體頻率具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　

13、　 2、HLA-B位點等位基因在高病毒載量組和低病毒載量組中的分布：高病毒載量組和低病毒載量組的HLA-BW4-80I/BW6雜合子頻率分別為9.8％和35.3％，兩組具有統(tǒng)計學(xué)差異。帶有HLA-BW4-80I的純合子或雜合子個體頻率分別為11.8％和39.2％，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3、HLA-B位點等位基因在CD4+T細胞數(shù)≥500cells/μ1組和CD4+T細胞數(shù)＜500cells/μ1中的分布：兩組的HLA-BW4

14、-80I/BW6雜合子頻率分別為5.6％和31.8％，有統(tǒng)計學(xué)差異。帶有HLA-BW4-80I的純合子或雜合子個體頻率分別為11.1％和33.3％，有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 三、KIR3DS1/KIR3DL1與HLA-Bw4-80I基因聯(lián)合表達
　　 與HIV-1感染者疾病進程相關(guān)性KIR3DS1、BW4-80I和CD4+T細胞計數(shù)共同分析發(fā)現(xiàn)：KIR3DSl與BW4-801聯(lián)合表達對CD4+T細胞計數(shù)的影響比KIR3DS1

15、和BW4-80I單獨存在時的作用有顯著趨勢，其與病毒載量共同分析發(fā)現(xiàn)：KIR3DS1和BW4-80I對病毒載量的影響在聯(lián)合表達時作用更加顯著。
　　 四、KIR3DS1和KIR3DL1的mRNA的表達量比較
　　 1、KIR3DS1的mRNA的表達量比較：發(fā)現(xiàn)典型進展組KIR3DS1的表達量小于長期不進展組，高病毒載量組的KIR3DS1的表達量小于低病毒載量組，CD4'T細胞數(shù)＜500cells/μl組的KIR3DS1的

16、表達量小于CD4+T細胞數(shù)≥500cells/μl。
　　 2、KIR3DL1的mRNA的表達量比較：典型進展組KIR3DL1的表達量高于長期不進展組，高病毒載量組的KIR3DL1的表達量和低病毒載量組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，CD4′T細胞數(shù)＜500cells/μ1組的KIR3DL1的表達量高于CD4'T細胞數(shù)≥500cells/μl組。
　　 3、TNF-α的mRNA的表達量比較：TNF-α表達量各組見相比無顯著差異。