大菱鲆多聚免疫球蛋白受體基因的克隆及表達研究.pdf

1、多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor，pIgR)是黏膜免疫系統(tǒng)的關鍵因子，能夠介導多聚免疫球蛋白向黏液中的轉運和分泌。pIgR的有效分泌是多聚免疫球蛋白發(fā)揮黏膜防御功能的必要條件。隨著對魚類免疫球蛋白研究的深入，pIgR的研究也成為熱點。pIgR在生物進化過程中非常保守，目前已經在多種硬骨魚中展開了廣泛的研究。
　　本論文克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus) p

2、IgR的基因全序列，分析了該基因在不同組織內的差異表達情況以及免疫刺激后在不同組織中的應答表達，并對其進行體外表達，研制出大菱鲆pIgR多克隆抗體，利用該多抗研究了pIgR在4種黏膜組織中的定位，為進一步探討pIgR的特性及功能奠定了基礎。具體的研究結果如下：
　　利用同源克隆和cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends，RACE)，首次得到了大菱鲆pIgR完整的cDNA序列，全長1

3、584bp，該序列包含一個1005 bp的開放閱讀框及5'和3'UTR，編碼334個氨基酸。同源性比較發(fā)現(xiàn)大菱鲆pIgR氨基酸序列與牙鲆(Paralichthys olivaceus)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)的序列相似性分別是74％、74%和59%，表現(xiàn)出較高的保守性。多序列比對顯示硬骨魚pIgR包含兩個ILD(Ig-like domain)，分別對應哺乳

4、類的ILD1和ILD5區(qū)域。系統(tǒng)進化樹分析表明，大菱鲆pIgR和牙鲆的聚為一支。
　　利用半定量RT-PCR檢測pIgR在健康大菱鲆各組織中的差異表達，結果顯示pIgR在健康大菱鲆各組織中均有表達，但表達水平不同，其中在黏膜相關淋巴組織中表達最強，該基因在皮膚、鰓、胃、腸中的表達量最高，肝臟、脾和頭腎次之，在肌肉中的表達量是最低的，可以說明該基因與大菱鲆的黏液免疫球蛋白的轉運密切相關。經滅活的鰻弧菌菌液浸泡處理后，實時熒光定量PC

5、R檢測結果顯示，大菱鲆各組織中pIgR的相對表達量在72h內均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在48h內均有一個最高值出現(xiàn)，且黏膜相關淋巴組織中峰值出現(xiàn)較早，說明pIgR在硬骨魚類黏膜免疫中發(fā)揮了重要作用。
　　成功地構建了表達大菱鲆pIgR ORF的重組質粒，誘導表達后得到包涵體形式的pIgR重組蛋白，分子量為58.8kDa。以純化的pIgR重組蛋白為抗原，獲得鼠抗大菱鲆pIgR抗血清。Western blotting結果顯示，鼠抗大菱

6、鲆pIgR抗血清可與重組蛋白發(fā)生特異性結合。
　　利用大菱鲆pIgR多克隆抗體和免疫組織化學技術，對大菱鲆的皮膚、鰓、胃和腸4種黏膜組織進行了pIgR定位觀察，發(fā)現(xiàn)pIgR在這4種組織中均有分布，且主要分布在上皮細胞的表面，與其結合并轉運多聚免疫球蛋白的功能相對應，為pIgR在硬骨魚類黏膜免疫中發(fā)揮重要作用奠定組織結構基礎。
　　以上所有的研究結果表明，pIgR和多聚免疫球蛋白的轉運密切相關，在魚類黏膜免疫中發(fā)揮著重要的作用