膿毒癥血清細胞因子與肝臟功能及其線粒體損傷的相關性研究.pdf

1、目的：
　　 膿毒癥（sepsis）是感染引起的全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），其本質(zhì)是大量細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放導致的宿主自身免疫性損傷，進一步發(fā)展可導致膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）等嚴重的并發(fā)癥。雖然有抗生素的廣泛應用，但MODS的死亡率仍然很高，是危重病醫(yī)學

2、領域的難題。隨著分子生物學的快速發(fā)展，人們已逐步認識到，機體對感染的反應最終表現(xiàn)在細胞、組織、器官和整體層次上。肝臟是機體進行物質(zhì)和能量代謝的重要器官，且膿毒癥早期肝臟功能及其線粒體極易受損傷。因此本課題通過檢測和觀察膿毒癥大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10水平變化和肝臟功能、形態(tài)及其線粒體變化，從而研究膿毒癥大鼠血清細胞因子水平與肝臟功能及其線粒體損傷的相關性，探討血清細胞因子水平對肝臟功能及其線粒體損傷可能的機制，為預防和診治

3、膿毒癥肝臟損傷提供實驗參考。
　　 方法：
　　 1.建立動物模型及分組膿毒癥模型采用腹腔注射10mg/kg LPS建立。80只無特定病原體(Specefic Pathogen Free，SPF)級SD雄性大鼠隨機分為8組：正常對照組（n=10）：腹腔注射等容量的生理鹽水；實驗組（n=70）：分為LPS注射后3、6、12、24、36、48、72小時7個時間點，每個時間點10只（n=10），腹腔注射LPS10mg/kg。<

4、br>　　 2.檢測指標及方法2.1 大鼠一般情況觀察正常對照組大鼠和注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h、48h和72h組大鼠的精神狀態(tài)、有無腹瀉、豎毛、皮膚粘膜出血的情況，并測量肛溫、心率和呼吸頻率，檢測血漿LPS水平。
　　 2.2 大鼠炎癥反應指標運用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測正常對照組大鼠和注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h、48h和72hLPS組大鼠血清TNF-α、IL-

5、6、IL-10和MBL的濃度水平。
　　 2.3 大鼠肝功能指標肝功能指標：運用全自動生化分析儀檢測大鼠血清ALT、AST、LDH、TG、HDL和LDL水平。
　　 2.4 大鼠肝臟組織病理切片觀察2.5大鼠肝臟組織切片凋亡原位末端標記檢測凋亡率采用TUNEL法進行檢測。
　　 2.6 大鼠肝臟組織粒體損傷相關指標采用差速離心法提取大鼠肝臟線粒體，JC-1染料染色，流式細胞儀檢測線粒體腫脹程度和線粒體膜電位。電鏡

6、觀察大鼠肝臟線粒體損傷狀況，按照Flameng分級方法對線粒體進行半定量評分。
　　 3.統(tǒng)計方法獲得的數(shù)據(jù)SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，結果用均值±標準差(±s)表示；多組間比較采用單因素方差分析，在多樣本均數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學意義時進行均數(shù)兩兩比較，方差齊性者采用LSD法分析組間差異，方差不齊者采用Games-Howell法分析組間差異；重復測量資料采用重復測量方差分析；相關分析采用Pearson進行檢驗；α值界定為0.05

7、。
　　 結果：
　　 1.動物一般情況1.1 與正常對照組相比，LPS-3h、LPS-6h、LPS-12h、LPS-24h組呼吸、心率顯著升高（P<0.05），以LPS-6h升高最明顯，LPS-36h、LPS-48h、LPS-72h組大鼠呼吸心率與正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　 1.2 與正常對照組相比，注射LPS各組大鼠血漿LPS水平均顯著升高（P<0.05）。
　　 2.大鼠炎癥反

8、應指標2.1各組大鼠血清TNF-α水平的比較腹腔注射LPS后3h、6h、12h和72h組與正常對照組相比，大鼠血清TNF-α水平顯著升高（P<0.05），以LPS-3h組血清TNF-α水平升高最為顯著，LPS-24h和LPS-36h組血清TNF-α水平與正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　 2.2各組大鼠血清IL-6水平的比較腹腔注射LPS后3h、6h、12h和24h組與正常對照組相比，大鼠血清IL-6水平顯著升

9、高（P<0.05），以LPS-3h組血清IL-6水平升高最為顯著，LPS-36h、LPS-48h和LPS-72h組血清IL-6水平與正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　 2.3各組大鼠血清IL-10水平的比較腹腔注射LPS后3h、6h、12h、24h、36h和48h組與正常對照組相比，大鼠血清IL-10水平顯著升高（P<0.05），以LPS-6h組血清IL-10水平升高最為顯著，LPS-72h組血清IL-10水平與

10、正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　 3.大鼠肝臟生化指標各組大鼠血清ALT、AST和LDH水平的比較腹腔注射LPS后3h、6h組與正常對照組相比，大鼠血清ALT、AST和LDH水平顯著升高（P<0.05）。以LPS-6h組血清ALT、AST和LDH水平升高最為顯著。LPS-72h組血清AST和LDH水平與正常對照組相比差異明顯（P<0.05）。
　　 4.大鼠肝臟組織切片凋亡率腹腔注射LPS后6h、12h、

11、24h和36h組與正常對照組相比，大鼠肝臟組織切片凋亡率顯著升高（P<0.05），以LPS-12h組肝臟組織凋亡率升高最為顯著，LPS-48h、LPS-72h組肝臟組織凋亡率與正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）
　　 5.大鼠肝臟細胞線粒體指標
　　 5.1各組大鼠肝臟線粒體腫脹程度和膜電位的比較腹腔注射LPS后各組大鼠間肝臟線粒體腫脹程度的比較差異不明顯，不具有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 腹腔注

12、射LPS后3h、6h、12h、24h、36h和48h組與正常對照組相比，大鼠肝臟細胞線粒體膜電位水平顯著降低（P<0.05），以LPS-24h組肝臟線粒體膜電位降低最為明顯（P<0.05），LPS-72h組線粒體膜電位與與正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）
　　 5.2各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察及半定量分析腹腔注射LPS后12h、24h、36h和48h組與正常對照組相比，各組大鼠肝臟線粒體電鏡半定量評分顯著上升（P<0.

13、05），以LPS-24h組線粒體半定量評分上升最為顯著，LPS-72h組線粒體半定量評分與正常對照組相比無明顯差異（P>0.05）。
　　 6.大鼠各指標的相關性分析大鼠血清TNF-α水平與血清ALT、AST和LDH水平呈具有顯著統(tǒng)計學意義的正相關，相關系數(shù)分別為0.475（P<0.05）、0.533（P<0.05）和0.633（P<0.05）。
　　 大鼠血清IL-6水平與血清ALT、AST和LDH水平呈呈具有顯著統(tǒng)計

14、學意義的正相關，相關系數(shù)分別為0.42（P<0.05）、0.52（P<0.05）和0.394（P<0.05）。
　　 大鼠血清IL-10水平與血清ALT和AST水平的變化呈具有顯著統(tǒng)計學意義的正相關，相關系數(shù)分別為0.301（P<0.05）和0.278（P<0.05）；與血清LDH水平的變化無明顯相關性，相關系數(shù)為0.099（P>0.05）。
　　 大鼠肝臟線粒體膜電位與血清ALT、AST和LDH水平的變化無明顯性相關性

15、，相關系數(shù)分別為0.042（P>0.05）、0.007（P>0.05）和0.182（P>0.05）。
　　 大鼠肝臟線粒體膜電位與血清IL-6和IL-10水平的變化呈具有顯著統(tǒng)計學意義的負相關，相關系數(shù)分別為－0.451（P<0.05）和－0.721（P<0.05）；與血清TNF-α水平的變化無明顯相關性，相關系數(shù)為－0.1（P>0.05）。
　　 結論：
　　 1.膿毒癥血清TNF-α、IL-6和IL-10水

16、平呈時相性變化，其峰值時間早于肝臟功能、形態(tài)及肝臟線粒體損傷時間。
　　 2.膿毒癥血清TNF-α水平呈雙峰性改變，說明可能與機體存在二次打擊相關。
　　 3.膿毒癥時血清TNF-α、IL-6和IL-10水平與肝臟功能損傷呈正相關，提示血清TNF-α、IL-6和IL-10水平升高可能是肝臟功能損傷的因素。
　　 4.膿毒癥肝臟線粒體具有可逆性，其膜電位與血清IL-6和IL-10水平呈負相關，提示血清IL-6