紅花釣鐘柳中松果菊苷的分離純化、動態(tài)變化及松果菊苷生物合成途徑中部分酶的基因工程研究.pdf

1、松果菊苷既是一種咖啡酸類衍生物，也是一種苯乙醇苷類化合物，具有多種藥理學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護作用、保肝作用以及對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用。松果菊苷最早發(fā)現(xiàn)于狹葉松果菊，其含量約為0.2％，后亦在克氏釣鐘柳中發(fā)現(xiàn)，含量約為0.09％。目前，松果菊苷主要從一種寄生于梭梭的管花肉蓯蓉中提取。在2005版中華人民共和國藥典中，管花肉蓯蓉的唯一質(zhì)量控制標準是，松果菊苷的含量不低于1.O％。管花肉蓯蓉只分布于沙漠和戈壁一帶，生長緩慢，

2、且難于栽種。然而，近年來隨著松果菊苷商業(yè)價值的不斷提高，管花肉蓯蓉的市場需求也在不斷增長，管花肉蓯蓉被過度開發(fā)，已經(jīng)成為瀕危植物。因此，尋找管花肉蓯蓉的替代資源顯得尤為緊迫。
　　 本研究通過高效液相色譜篩選到富含松果菊苷的藥源植物紅花釣鐘柳(Penstemonbarbatus(Can.)Roth)，利用高速逆流色譜快速分離制備松果菊苷純品用于波譜學(xué)鑒定。為了提高次生代謝產(chǎn)物松果菊苷的含量，利用分子生物學(xué)方法，在其生物合成的基因

3、工程領(lǐng)域開展了探索性研究。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)紅花釣鐘柳中含有松果菊苷，并測定了根和葉中含量的年變化。
　　 通過篩選首次發(fā)現(xiàn)紅花釣鐘柳含有松果菊苷，其根和葉中松果菊苷的含量隨季節(jié)變化，在一年中，最高含量分別在十一月和五月達到7.25±0.36mg/g和9.09±0.32mg/g。結(jié)果表明，紅花釣鐘柳中松果菊苷的含量十分接近管花肉蓯蓉中松果菊苷的含量水平，其有可能替代管花肉蓯蓉，而用于規(guī)模化生產(chǎn)松果菊

4、苷。
　　 2.利用循環(huán)高速逆流色譜等技術(shù)從紅花釣鐘柳根中得到含量為96.3％的松果菊苷純品42.0mg，并確定其結(jié)構(gòu)。
　　 從紅花釣鐘柳中分離得到松果菊苷純品。利用50％甲醇超聲提取20g紅花釣鐘柳根的粉末，所得到的甲醇提取物經(jīng)AB-8樹脂預(yù)純化后，以正丁醇：甲醇(1：1，v/v)為溶劑系統(tǒng)，通過經(jīng)典高速逆流色譜和循環(huán)高速逆流色譜純化。最終獲得了純度為96.3％的松果菊苷42.0mg。循環(huán)HSCCC的回收率為91.0

5、％。獲得的松果菊苷純品由IR,1HNMRand13CNMR進行了結(jié)構(gòu)確認。
　　 3.完成了狹葉松果菊中3-脫氫奎尼酸合成酶基因aroB的克隆及其組織表達特征研究。
　　 以狹葉松果菊(Echinacea.angustifoliaDC)組培苗為材料，用Trizol法提取總RNA，根據(jù)已有的3-脫氫奎尼酸合成酶基因aroB保守氨基酸序列設(shè)計簡并引物，通過RT-PCR擴增得到1條289bp的aroB基因同源片段。利用該已知中

6、間序列，通過快速擴增cDNA末端技術(shù)(RACE)及序列拼接,最終得到該基因cDNA序列，命名為EanaroB，Genbank登錄號為EU293857。分析結(jié)果表明，EanaroBcDNA長1424bp，包含一個1326bp的開放讀碼框，氨基酸序列同源分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EanaroB編碼的氨基酸序列與番茄、葡萄、擬南芥、山毛櫸的aroB同源性都在80％左右，表明aroB氨基酸序列具有較強的保守性。半定量RT-PCR結(jié)果表明，狹葉松果菊Eana

7、roB基因在狹葉松果菊的根、莖、葉、花中均有表達，但花和葉中的表達量較高，在根和莖中較少。
　　 4.構(gòu)建了pCAMBIA2301G-EaC4H1高效植物表達載體并獲得基因工程農(nóng)桿菌對含有源于狹葉松果菊的EaC4H1(Genbank登錄號為EU676019)的pMD18-T和中間表達載體pCAMBIA2301G分別進行SacⅠ和XbaⅠ雙酶切。由于EaC4H1基因內(nèi)含有SacⅠ酶切位點，經(jīng)不完全酶切產(chǎn)生4條電泳條帶，回收1602

8、bp的目的基因條帶和約12kb的pCAMBIA2301G載體骨架條帶。將回收的pCAMBIA2301G載體骨架與酶切后產(chǎn)生的EaC4H1目的基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。抽提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。經(jīng)PCR驗證，獲得與目的基因大小一致的條帶。結(jié)果表明工程農(nóng)桿菌LBA4404-pCAMBIA2301G-EaC4H1已構(gòu)建成功。上述工程菌可用于遺傳轉(zhuǎn)化狹葉松果菊或紅花釣鐘柳，對在分子遺傳學(xué)水平上探討CAH在咖啡酸衍生物生物合成中的作