三七皂苷生物合成途徑關鍵酶基因和miRNA的挖掘與分析.pdf

1、三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]，又名田七、山漆，為五加科(Araliceae)人參屬(Panax)多年生草本植物，是我國著名的傳統(tǒng)中藥，應用歷史悠久，收載于歷年《藥典》。三七主要以根和根莖入藥，性溫、味甘、微苦，具有散瘀止血，消腫定痛之功效。三七皂苷為三七的主要活性成分，主要包括人參皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1，對防治心腦血管疾病有顯著作用;還具有降血脂、降血糖、降血壓、抗炎癥、抗疲勞、抗氧

2、化、抗血栓、抗動脈粥樣硬化、保肝和神經保護等方面的藥理活性。
　　現有的三七年產量已供不應求，導致價格持續(xù)攀升。傳統(tǒng)的栽培、育種等方式難以快速地提高三七的皂苷含量。因此，亟待探索三七皂苷生物合成的分子調控機制，才能通過改良單個或多個酶促反應，實現從分子水平提高三七皂苷產量，進而拓寬三七產業(yè)發(fā)展途徑的目標。本論文擬通過挖掘三七皂苷生物合成途徑關鍵酶基因和miRNA，以期解析三七皂苷生物合成的分子機理，為三七的遺傳改良提供依據。主要研

3、究結果如下:
　　1.隨著生長年限的增加，廣西三七根部的各皂苷成分及總皂苷含量不斷增加，除R1含量在2年生和1年生間差異不顯著外，不同年限之間的分體皂苷和總皂苷含量均達極顯著差異。
　　2.從轉錄組中得到4.62 Gb的原始數據，通過拼接得到96，704條Unigenes。與次生代謝相關的Unigenes有2，517條，其中涉及萜類骨架合成的Unigenes有194條。利用轉錄組數據發(fā)現了三七皂苷生物合成通路中所有的基因，涉

4、及到22種基因。另外還得到了384條CYP450基因的Unigenes、120條glycosyltransferase基因的Unigenes和219條glucosyltransferase基因的Unigenes。這些Unigenes是今后對三七皂苷生物合成進行全面調控的重要基因資源。
　　3. 在1年生(1 a)、2年生(2a)、3年生(3a)表達譜中均得到了500萬條以上Cleantags，去冗余后得到157，000條以上不同種

5、類的Tags。2a_1a中，有1，008個基因上調，535個基因下調;3a_1a中，1，841個基因上調，1，891個基因下調;3a_2a中，1，387個基因上調，1，841個基因下調。這些差異表達的基因可能參與三七皂苷的生物合成。
　　4.通過轉錄組和表達譜的聯合分析，共發(fā)現9條候選CYP450基因和8條候選UDPG基因可能參與三七皂苷的生物合成。
　　5.利用RT-PCR技術擴增獲得PnFPS、PnSS、PnSE、PnC

6、AS的ORF全長序列，并運用生物信息學方法預測其蛋白結構和功能位點，為鑒定這些基因的蛋白功能、研究三七皂苷類化合物的生物合成分子機制奠定了基礎。
　　6.在1a、2a、3a小RNA庫中均得到了2，000萬條以上的clean reads，長度分布以21nt和24nt為主。共發(fā)現154種已知miRNA（屬116個基因家族）和77種新miRNA。
　　7.在2a_1a、3a_1a和3a_2a中，分別有118個、121個和143個極

7、顯著差異表達的已知miRNA，其中，極顯著下調的分別有55個、42個和101個;兩兩庫間顯著差異表達的新miRNA分別有13個(2a_1a)、10個(3a_1a)和14個(3a_2a)，其中顯著下調的分別有7個、4個和6個。這些差異表達的miRNA可能參與三七皂苷的生物合成。
　　8.發(fā)掘到8個miRNA和1類WRKY轉錄因子可能與三七皂苷含量相關，以及21個與植物-病菌互作相關的miRNA。
　　通過對三七皂苷生物合成途徑