甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白對大鼠小腸上皮細胞鈣吸收機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身骨量減少。骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞致使骨脆性增加從而易骨折的疾病，被稱之為“隱形殺手”。它與年齡、性別、飲酒、雌激素缺乏、長期使用糖皮質(zhì)激素等多種因素有關(guān)。隨著世界人口老齡化的趨勢越來越明顯，OP已成為未來醫(yī)療和社會的重大問題。許多消化系統(tǒng)疾病如胃切除術(shù)、慢性肝病、炎癥性腸病等有較高的骨質(zhì)疏松發(fā)生率[1]，但目前對這些疾病引起骨質(zhì)疏松的機理尚不明確
　　

2、在對胃切除術(shù)后骨病的多年研究中，有學(xué)者提出在胃內(nèi)對骨代謝其主要作用的物質(zhì)存在于胃底泌酸粘膜中的腸嗜鉻樣細胞(enterochromaffin-like cell，ECLcell)中，胃泌素可以通過刺激這種激素的分泌來間接發(fā)揮降低血鈣濃度和刺激鈣吸收入骨的作用
　　 鈣是重要的骨礦物質(zhì)元素，骨鈣鹽不僅具有結(jié)構(gòu)功能，還具有代謝作用，在機體需要時從骨中釋放入血維持細胞和體液中鈣濃度的穩(wěn)定。鈣的減少和丟失是引起骨密度下降進而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松

3、的重要因素之一。在脊椎動物中，小腸對飲食中鈣的吸收是機體獲得鈣的主要途徑，小腸鈣吸收對骨骼生長和代謝發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)小腸粘膜病變或切除小腸后可導(dǎo)致骨密度下降，骨質(zhì)疏松發(fā)病率增加。
　　 近端小腸（十二指腸和近端空腸）是鈣吸收的主要部位，體內(nèi)外研究均證實小腸上皮鈣吸收受多種激素如活性維生素 D3(1alpha-dihydroxycholecalciferol，1，25(OH)2D3)，雌激素，糖皮質(zhì)激素，甲狀旁腺激素(PT

4、H)的調(diào)控。小腸上皮鈣吸收過程極極其復(fù)雜，通常認為跨細胞轉(zhuǎn)運（主動轉(zhuǎn)運）途徑是近端小腸鈣吸收的主要方式。多種轉(zhuǎn)運蛋白在跨細胞轉(zhuǎn)運中發(fā)揮了重要的作用，例如小腸粘膜側(cè)膜上鈣通道瞬時受體電位香草酸亞型6（transient receptor potential vanilloid member6，TRPV6）和電壓依賴性鈣通道(voltage-dependent L-type calcium channel，Cav1.3)的開放使鈣進入細胞內(nèi)

5、，與胞漿內(nèi)的鈣結(jié)合蛋白(calcium-binding protein，Calbindin-D9k，Cabp)結(jié)合運輸至基底側(cè)，然后通過漿膜側(cè)鈉鈣交換器(sodium calcium exchanger1，NCX1)和質(zhì)膜鈣ATP酶(plasma membrane calcium ATPase1，PMCA1)出胞進入血循環(huán)。目前研究認為這些激素可通過影響上述轉(zhuǎn)運蛋白的一種或多種來對鈣吸收進行調(diào)控。如泌乳素通過磷脂酰肌醇3激酶(phosp

6、hoinositide3-kinase，PI3K)/蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)信號通路調(diào)節(jié)Cav1.3和PMCA1的表達來影響小腸上皮細胞鈣的吸收和轉(zhuǎn)運。
　　 PTHrP基因結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，有九個外顯子，通過選擇性剪切和翻譯后修飾主要產(chǎn)生N端(1-36)，中間區(qū)域（87-106，核定位信號，NLS）及C端(107-139)三個活性肽段，這三種肽段可與獨自受體結(jié)合參與多種生理過程。研究表明PTHrP可影

7、響骨、腎、乳腺、胎盤等多種組織中的鈣吸收，但其作用受體、作用肽段卻不同。例如PTHrP(1-34)與受體PTHR1結(jié)合通過PKA和PKC兩條信號傳導(dǎo)通路促進成骨細胞鈣吸收的增加，而在調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)層細胞的單向鈣離子轉(zhuǎn)運中，發(fā)揮作用的肽段則是67-86，且其結(jié)合受體亦不同于PTHR1。在硬骨魚的小腸上皮中則檢測到PTHrP的一種新受體PTHR3的存在。以上研究結(jié)果顯示在不同種屬、不同組織中PTHrP可能與不同受體結(jié)合來調(diào)節(jié)鈣離子的轉(zhuǎn)運。PT

8、HrP在哺乳動物小腸上皮細胞所結(jié)合的受體有待于進一步研究。細胞膜相關(guān)性快反應(yīng)類固醇結(jié)合蛋白(membrane-associated，rapid response，steroidbinding，1，25D3-MARRS)/PDIA3/ERp57是蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶家族中的一員，是人類進化中較為保守的蛋白，可在小腸、腎、腦、骨等多種組織中表達，參與糖基化、離子遷移、能量代謝甚至基因轉(zhuǎn)錄等多個生理過程。近年研究發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3除與

9、核受體VDR結(jié)合外，還可與小腸上皮細胞膜受體1，25D3-MARRS蛋白結(jié)合，通過PKA和PKC兩條信號通路參與鈣、磷的迅速吸收和轉(zhuǎn)運。由于其親本蛋白PDI能夠與雌激素和甲狀旁腺激素等激素結(jié)合，有學(xué)者推測1，25D3-MARRS蛋白是多種激素的選擇性受體。根據(jù)上述研究結(jié)果我們推測，小腸上皮細胞膜受體1，25D3-MARRS蛋白可能是PTHrP的作用受體之一，PTHrP可與1，25D3-MARRS蛋白結(jié)合促進小腸上皮的鈣吸收。
　　

10、 根據(jù)國內(nèi)外研究現(xiàn)狀以及本課題組前期研究結(jié)果，我們提出以下假設(shè):PTHrP可能就是胃粘膜ECL細胞中維持骨鈣代謝的重要激素。PTHrP可能通過旁分泌或自分泌途徑作用到小腸上皮細胞，與膜受體1，25D3-MARRS蛋白結(jié)合，激活PKA和PKC等信號通路，調(diào)節(jié)Cav1.3/TRPV6等鈣轉(zhuǎn)運蛋白的表達，引起鈣離子的迅速吸收和轉(zhuǎn)運，進而維持機體鈣平衡和骨鈣代謝。這一假說如能證實，不僅能進一步明確小腸上皮細胞對鈣吸收和轉(zhuǎn)運的作用途徑，加深對P

11、THrP性質(zhì)和功能的認識，還有助于闡明胃腸道疾病誘發(fā)OP的病理機制，為OP的防治提供新的途徑。
　　 研究目的:
　　 研究目標(biāo)
　　 (1)明確PTHrP對小腸上皮細胞鈣吸收的作用受體及信號傳導(dǎo)途徑。
　　 (2)進一步闡明胃切除術(shù)后等消化道疾病誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的病理機制。
　　 研究方法:
　　 1胃粘膜PTHrP的檢測以及胃泌素干預(yù)后對PTHrP表達水平的影響
　　 收集人胃正

12、常粘膜，行RT-PCR方法從mRNA水平檢測PTHLH在人胃粘膜的表達，通過免疫組織化學(xué)方法對PTHrP在胃粘膜的分布進行定位研究。建立胃泌素干預(yù)大鼠模型，通過RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法來觀察胃泌素刺激對PTHLH/PTHrP表達水平的影響。
　　 2大鼠腸上皮細胞的培養(yǎng)
　　 大鼠腸上皮細胞(IEC-6)來自本實驗室收藏。細胞復(fù)蘇后在37℃、5％CO2條件下用含8％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，待細胞生長至80

13、％融合時用于各種實驗。
　　 3鈣離子吸收的檢測
　　 IEC-6細胞計數(shù)后濃度調(diào)整至1×104/mL，均勻接種于激光共聚焦顯微鏡專用的35mm2培養(yǎng)皿中，細胞密度達到50％左右時換為無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，次日用PBS洗滌兩遍后，進行細胞內(nèi)鈣離子探針fluo-4am的熒光裝載。在激光共聚焦顯微鏡下觀察施加刺激因素前后胞內(nèi)熒光強度的變化，獲得反應(yīng)細胞內(nèi)鈣離子濃度動態(tài)變化的曲線。如觀察不同抑制劑對鈣離子吸收的影響，則在裝載完

14、探針后，先在培養(yǎng)皿中加入不同的抑制劑孵育指定的時間，然后再在共聚焦顯微鏡下加入刺激劑，觀察并記錄細胞內(nèi)熒光強度的變化。
　　 4 PTHrP影響小腸上皮鈣吸收的作用片段
　　 在共聚焦培養(yǎng)皿中，分別加入6nM的PTHrP(1-40)、(67-86)、(134-173)三種作用肽段，觀察不同片段的PTHrP對鈣離子吸收的影響;培養(yǎng)板的細胞中分別加入不同片段的PTHrP，6小時后收集細胞分別提取RNA和蛋白，通過RT-PCR

15、和western-blot實驗檢測觀察不同片段的PTHrP對鈣通道蛋白的影響。
　　 5 PTHrP(1-40)影響鈣離子吸收的濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系
　　 分別觀察不同濃度(0.1nm，1nm，3nm，6nm，10nm)下PTHrP對小腸上皮細胞鈣吸收和相關(guān)鈣通道蛋白的劑量-效應(yīng)關(guān)系，和不同時間(0，3h，6h，9h，12h，24h)PTHrP對小腸上皮細胞中鈣通道蛋白的影響。
　　 6 PTHrP作用受體的研

16、究
　　 通過RT-PCR和western-blot方法檢測PTHrP刺激IEC-6細胞后PTHR1，PTHR2，以及1，25D3-MARRS等幾種受體基因和蛋白水平的變化。用抗體封閉方法觀察阻斷受體后PTHrP對IEC-6細胞中鈣吸收的影響。
　　 7鈣通道蛋白在PTHrP影響鈣吸收中的所發(fā)揮的作用
　　 用鈣通道阻斷劑或過飽和抗體封閉來封閉各種轉(zhuǎn)運蛋白的表達，結(jié)合瞬時轉(zhuǎn)染沉默相關(guān)鈣通道蛋白基因的表達，觀察干擾

17、前后PTHrP對IEC-6細胞中鈣吸收的影響。
　　 8 PTHrP對PKA、PKC信號通路的影響
　　 選取不同時間點(0，1m，3m，5m，7m，10m，15m，20m，30m，60m，90m，120m)，PTHrP刺激IEC-6細胞后PKA，PKC蛋白水平的變化。
　　 9 PKA、PKC信號通路在PTHrP影響IEC-6細胞中鈣吸收的作用
　　 觀察PKA、PKC抑制劑作用在IEC-6細胞中預(yù)孵育

18、30分鐘，再加入刺激PTHrP，觀察鈣離子吸收的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1 PTHLH/PTHrP在人和大鼠的正常胃粘膜中具有表達，胃泌素干預(yù)后PTHrP的mRNA水平表達顯著性增加，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 2在小腸上皮細胞中，PTHrP是通過片段1-40而不是67-86或134-173來發(fā)揮作用的。
　　 (1)在共聚焦顯微鏡下，分別加入6nm的不同活性片段的PTHrP，結(jié)果顯示僅有

19、1-40能夠引起胞內(nèi)鈣離子的顯著增加(與對照組相比，P＜0.05)，而另兩個片段67-86或134-173刺激組鈣離子吸收的變化無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 (2)通過RT-PCR和western-blot試驗也發(fā)現(xiàn)僅有片段1-40能夠引起鈣通道相關(guān)蛋白(主要為TRPV6，Cabp，PMCA，NCX)的基因和蛋白水平的表達升高(P＜0.05)，而片段67-86，和134-173刺激組對鈣通道蛋白的mRNA和蛋白的影響無統(tǒng)

20、計學(xué)差異。
　　 3 PTHrP(1-40)在低劑量6nM下即可引起小腸上皮細胞鈣離子的迅速吸收，而類似物PTH的作用濃度則是100nM(與PTHrP組相比，P＜0.05)。PTHrP在短時間內(nèi)即可引起鈣通道相關(guān)蛋白基因和蛋白水平的變化，在6小時內(nèi)即可引起鈣通道蛋白的顯著升高(P＜0.05）。
　　 4 PTHrP可能不是通過L-型鈣通道來引起鈣吸收的。PTHrP不引起L-型鈣通道蛋白cav1.3的表達增加(P＞0.05

21、），而L鈣通道阻滯劑尼群地平也不能阻斷PTHrP引起的鈣離子吸收增加，加入PTHrP刺激前后鈣熒光強度的變化有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-10.364, P＜0.001)。
　　 5在小腸上皮細胞中PTHrP可能是通過PTHR1受體來發(fā)揮作用的，在大鼠小腸上皮細胞中通過RT-PCR和western-blot試驗未檢測到PTHR2受體的表達。加入PTHR1抗體封閉后能夠阻斷PTHrP引起的鈣離子吸收（P＞0.05），而PTHR2受體封閉后則

22、不能阻斷該作用，刺激前后鈣離子熒光強度的變化具有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-4.760，P＜0.001)。另外我們從基因和蛋白水平檢測到PTHrP不能引起1，25D3-MARRS受體水平的變化，而用1，25D3-MARRS抗體封閉后也不能阻止PTHrP引起的鈣離子吸收的增加(t=-90.077，P＜0.001)。
　　 6鈣通道蛋白TRPV6，Cabp可以阻斷PTHrP引起的鈣離子吸收，PTHrP刺激前后鈣離子熒光強度變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P

23、＞0.05)，而PMCA和NCX則無此作用，加入PMCA和NCX的阻斷劑或抗體封閉后，PTHrP(1-40)仍可以促進鈣離子的迅速吸收(P＜0.05）。
　　 7 PTHrP可能是通過PKC而不是PKA信號通路來引起鈣吸收的。PKA抑制劑H-89不能阻斷PTHrP引起的鈣離子吸收，刺激前后變化有統(tǒng)計學(xué)差異(t=-7.472，P＜0.001)，而PKC抑制劑G(O)1918可以阻斷鈣離子的吸收（P＞0.05）。
　　 結(jié)論

24、:
　　 1 PTHrP在人和大鼠的正常胃粘膜的ECL細胞中表達，胃泌素刺激可以增加胃粘膜內(nèi)PTHrP的表達，提示PTHrP可能是消化道內(nèi)促進鈣吸收入骨和維持正常骨量的重要激素。
　　 2 PTHrP可以促進大鼠小腸上皮細胞的鈣離子吸收和鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的表達增加，主要是通過片段1-40來發(fā)揮作用的。
　　 3 PTHrP(1-40)對大鼠小腸上皮細胞的鈣吸收和鈣通道蛋白的影響作用迅速（6小時），作用劑量低，PTH

25、rP(1-40)主要可以引起跨細胞通路鈣通道相關(guān)蛋白(TRPV6，Cabp，PMCA，NCX)的基因和蛋白水平表達增加，提示PTHrP在大鼠小腸上皮細胞的鈣轉(zhuǎn)運機制中主要影響的是跨細胞主動轉(zhuǎn)運通路。
　　 4 PTHrP(1-40)可能不是通過L-型鈣通路來影響小腸上皮細胞鈣吸收的。
　　 5鈣通道蛋白TRPV6，Cabp可以阻斷PTHrP(1-40)引起的鈣離子吸收，可做為治療干預(yù)的靶點，而PMCA和NCX并不能阻斷P

26、THrP(1-40)引起的鈣吸收增加，PMCA和NCX是否在PTHrP引起鈣轉(zhuǎn)運中的發(fā)揮作用將有待于進一步的研究。
　　 6 PTHrP(1-40)在大鼠小腸上皮細胞上的作用受體可能是PTHR1而不是PTHR2，PTHR1而非PTHR2可以阻斷PTHrP(1-40)引起的胞漿內(nèi)鈣離子的吸收，1，25D3-MARRS受體可能不是PTHrP(1-40)作用在IEC-6細胞上的受體，1，25D3-MARRS不能阻止PTHrP(1-40