低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）在體外對(duì)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E細(xì)胞）轉(zhuǎn)分化的影響，為進(jìn)一步探討脂質(zhì)腎損害的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：NRK-52E細(xì)胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5％ CO2恒溫箱培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為（1）正常對(duì)照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；（2）洛伐他汀組（Lovastatin，Lov）：在培養(yǎng)液中加入Lov終濃度為

2、1μmol/L；（3）LDL組：加入不同濃度的LDL，其終濃度分別為50 mg/L、150 mg/L、250 mg/L；（4）LDL（250mg/L）+Lov（1μmol/L）組：在培養(yǎng)液中加入終濃度為250 mg/L的LDL和1μmol/L的Lov。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；RT-PCR法檢測(cè)NRK-52E細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）mRNA表達(dá)；Western印跡法檢測(cè)α-SMA

3、、E-cadherin蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、倒置顯微鏡觀察，正常對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞呈立方形或多角形，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征。加入不同終濃度的LDL（50mg/L、150 mg/L、250 mg/L）培養(yǎng)24h后，細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變長(zhǎng)、肥大，呈長(zhǎng)梭形，喪失其鋪路石樣生長(zhǎng)方式，表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，且隨LDL劑量的增加，成梭形改變的細(xì)胞數(shù)增多。在LDL+Lov組中，多數(shù)細(xì)胞仍保持正常上皮

4、細(xì)胞形態(tài)。而洛伐他汀組細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯變化。 2、RT-PCR結(jié)果表明：正常對(duì)照組細(xì)胞幾乎不表達(dá)α-SMA，而在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的LDL（50 mgL、150 mg/L、250 mg/L），隨LDL濃度的增加，α-SMA mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)，呈劑量依賴性。與正常對(duì)照組比較，不同濃度LDL刺激細(xì)胞，其α-SMA mRNA表達(dá)升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 3、RT-PCR結(jié)果顯示：正常對(duì)照組細(xì)胞E-cadh

5、erin mRNA呈高表達(dá)，在觀察的LDL50mg/L、150 mg/L、250 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨LDL濃度增加，細(xì)胞表達(dá)E-cadherin mRNA呈劑量依賴性逐漸減少，在LDL濃度為250 mg/L時(shí)作用最明顯。與正常對(duì)照組比較，各作用濃度點(diǎn)E-cadherin mRNA表達(dá)降低均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。 4、Western印跡和RT-PCR法檢測(cè)表明，正常對(duì)照組細(xì)胞幾乎不表達(dá)α-SMA mRNA

6、和蛋白，而高表達(dá)E-cadherin mRNA和蛋白。以250mg/L LDL刺激細(xì)胞，其α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組分別增高5.2倍和5.0倍（P<0.01），而E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)分別下降48.7％和24.9％（P<0.01）。在LDL+Lov組，細(xì)胞表達(dá)α-SMA mRNA和蛋白明顯低于LDL組（P<0.01），但明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01）；而E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)明顯高

7、于LDL組（P<0.01），低于正常對(duì)照組（P<0.01）。Lov組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：LDL以劑量依賴性誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，而洛伐他汀能部分阻斷LDL誘導(dǎo)的小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。 目的：探討低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用機(jī)制。 方法：RT-PCR法檢測(cè)NRK～52E細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、Smad2、Smad3和整合素鏈接酶（ILK）mRN

8、A表達(dá)；Western印跡法檢測(cè)磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）蛋白表達(dá)；ELISA法檢測(cè)上清液中TGF-β1蛋白分泌。 結(jié)果： 1、RT-PCR法檢測(cè)顯示，在LDL（250 mg/L）組，細(xì)胞表達(dá)TGF-β1mRNA明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而在Lov+LDL組，與LDL組比較，TGF-β1 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），但高于正常對(duì)照組（P<0.01）。Lov組

9、與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ELISA法結(jié)果顯示，細(xì)胞上清液中TGF-β1蛋白的含量，在正常對(duì)照組中為（279.40±28.42）pg/ml，在LDL組中增加至（536.89±56.88）pg/ml，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而在Lov干預(yù)的LDL組中，細(xì)胞上清液中TGF-β1蛋白的含量明顯減少（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組（P<0.05）；而Lov組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、（P>0.05）。 2、RT-PCR結(jié)果表明，LDL（250 mg/L）組，NRK-52E細(xì)胞表達(dá)Smad2，Smad3 mRNA顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01）；Lov+LDL組，細(xì)胞表達(dá)Smad2，Smad3 mRNA顯著低于LDL組（P<0.05），而Lov組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，LDL組細(xì)胞p-Smad2/3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01），Lov干預(yù)的L

11、DL組中p-Smad2/3表達(dá)明顯減弱（P<0.01），但明顯高于正常對(duì)照組（P<0.01）。 3、RT-PCR結(jié)果表明，LDL能上調(diào)ILK mRNA的表達(dá)，與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Lov能部分抑制LDL介導(dǎo)的ILK mRNA表達(dá)的上調(diào)，與LDL組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）。而Lov組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論：LDL誘導(dǎo)腎