小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)

1、腸上皮細(xì)胞,腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells,IECS）是具有極性的柱狀上皮細(xì)胞，參與腸道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等，黏膜上皮內(nèi)含有大量的免疫細(xì)胞和免疫分子，是機(jī)體內(nèi)最大的免疫組織。IEC是體內(nèi)更新最快的一類(lèi)細(xì)胞，對(duì)維持腸上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成為研究細(xì)胞增殖和分化調(diào)控機(jī)制、營(yíng)養(yǎng)素對(duì)腸上皮的作用、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腸道免疫等提供了理想的體外模型。,膠原酶Ⅳ消化法得到的兔

2、IEC,雞胚盲腸上皮細(xì)胞呈鋪石路生長(zhǎng)（400×）,準(zhǔn)備工作,1、對(duì)所需用到的器皿的清洗、干燥、消毒2、培養(yǎng)基和其他試劑的配制、分裝及滅菌3、無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒4、培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試,IEC的培養(yǎng)流程,幼齡動(dòng)物小腸,→,單個(gè)細(xì)胞,→,細(xì)胞懸液,→,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),→,細(xì)胞懸液,→,細(xì)胞株或細(xì)胞系,剪碎,胰蛋白酶,原代培養(yǎng),胰蛋白酶,傳代培養(yǎng),IEC的培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。分離細(xì)胞后立即進(jìn)行培養(yǎng)稱(chēng)為原

3、代培養(yǎng)，一般將培養(yǎng)的第1代與傳10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)；存活的原代培養(yǎng)細(xì)胞（細(xì)胞株）進(jìn)行傳代，稱(chēng)為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。,影響IEC培養(yǎng)的因素,1、材料來(lái)源以取自剛出生且未進(jìn)奶的新生大鼠最好。對(duì)已進(jìn)食的新牛大鼠，分離培養(yǎng)過(guò)程中使用的培養(yǎng)液、細(xì)胞洗滌液(Hanks液)和組織分散液中均應(yīng)加入2倍濃度的抗生素。2、消化酶的選擇用0．25％胰酶消化組織，室溫下需約1 h，分離得到的大部分為單個(gè)細(xì)胞，貼壁和生長(zhǎng)能力均較差。膠原酶Ⅺ與

4、中性蛋白酶I的聯(lián)合使用，室溫消化約40 min即可得到IEC團(tuán)塊，其貼壁能力較強(qiáng)，牛長(zhǎng)狀態(tài)良好，還可減輕對(duì)細(xì)胞毒性損害，縮短消化作用時(shí)間，且腸絨毛細(xì)胞團(tuán)的產(chǎn)率較高。用嗜熱菌蛋白酶作為分離IEC的消化酶，經(jīng)簡(jiǎn)便純化，即可獲得較純的IEC。,3、血清濃度使用胎牛血清濃度不宜過(guò)高，10%-20%胎牛血清常使非腸黏膜上皮細(xì)胞增殖。IEC體外培養(yǎng)所用的胎牛血清的濃度一般不超過(guò)5%。4、IEC的純度 少量異源細(xì)胞的存活對(duì)IEC生長(zhǎng)繁殖也是

5、重要的，因?yàn)镮EC與間質(zhì)細(xì)胞存在相互作用關(guān)系。同時(shí)應(yīng)防止其過(guò)度繁殖，如降低FCS濃度可減少成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖。應(yīng)用肝素可抑制平滑肌樣細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)IEC生長(zhǎng)增殖。,5、培養(yǎng)基培養(yǎng)基以新鮮配制為佳，低溫(4℃)儲(chǔ)存不宜超過(guò)1周。EGF對(duì)于促進(jìn)IEC貼壁十分重要，它與胰島素合用可促進(jìn)IEC生長(zhǎng)繁殖。生長(zhǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、胰島素和谷氨酰胺等更利于原代培養(yǎng)的上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。6、酸堿度最適pH因細(xì)胞不同及動(dòng)物種屬不同而異。

6、最適pH有利于細(xì)胞本身的酶及其他生長(zhǎng)因子發(fā)揮較好的效果，從而影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的生存。IEC培養(yǎng)最適pH值為7．2～7．4。,IEC的鑒定,用消化酶分離培養(yǎng)的細(xì)胞僅憑光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察不能鑒定為IEC，尚需其他較為特意的鑒定方法。1、堿性磷酸酶染色法 影響因素多，陽(yáng)性率低。2、電鏡法 用電子顯微鏡掃面觀察細(xì)胞橋粒和刷狀緣是鑒定上皮細(xì)胞很有效的方法，但價(jià)格昂貴。3、免疫熒光法 采用特異的抗人上皮細(xì)胞膜抗原或角蛋白，特