新基因Mipu1對(duì)H9c2心肌細(xì)胞Bid基因表達(dá)的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，心血管疾病的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡有關(guān)。多種刺激均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，如缺氧、缺血再灌注、氧化應(yīng)激及腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factorα，TNFα）等。其中，TNFα可通過(guò)與心肌細(xì)胞膜上TNF-R1結(jié)合，激活死亡受體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Mipu1是本實(shí)驗(yàn)室克隆的一個(gè)大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的新基因（GenBank登錄號(hào)AY221750），已證實(shí)Mipu1是一個(gè)鋅指蛋白型轉(zhuǎn)錄抑制因子。而

2、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族成員Bid基因啟動(dòng)子區(qū)含有Mipu1的結(jié)合位點(diǎn)，因此本研究旨在觀察Mipu1對(duì)TNFα誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，及Mipu1對(duì)Bid基因表達(dá)的調(diào)控作用，從而探討Mipu1減輕TNFα所致H9c2心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 本研究擬采用TNFα（20 ng/ml，24h）處理大鼠心肌細(xì)胞H9c2，建立細(xì)胞凋亡模型。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Mipu1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Mipu1，使細(xì)胞過(guò)表達(dá)Mipu1。實(shí)驗(yàn)

3、分為pcDNA3.1、pcDNA3.1+TNFα、pcDNA3.1-Mipu1、pcDNA3.1-Mipu1+TNFα四組。為觀察Mipu1對(duì)TNFα所致H9c2細(xì)胞凋亡的影響，采用Hoechst染色、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）及Caspase活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率及Caspase8、9、3的活性；為觀察Mipu1對(duì)凋亡相關(guān)基因Bid基因表達(dá)水平的影響，采用細(xì)胞間接免疫熒光術(shù)、Western-blot、RT-PC

4、R及熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time quantitative PCR）方法檢測(cè)Bid蛋白及mRNA的表達(dá)；為進(jìn)一步探討Mipu1對(duì)Bid基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制，采用熒光素酶報(bào)告基因及Target Detection Assay檢測(cè)Bid基因轉(zhuǎn)錄活性及Mipu1蛋白與Bid啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用。 主要結(jié)果如下：①TNFα處理H9c2細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡百分率明顯增加（p<0.01 VS pcDNA3.1）；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-

5、Mipu1后，TNFα誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡百分率增加受到明顯抑制（p<0.01 VSpcDNA3.1+TNFα）。TNFα處理后，Caspase-8和Caspase-3活性明顯增加（p<0.01 VS pcDNA3.1）；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mipu1后，TNFα誘導(dǎo)的Caspase-8和Caspase-3活化明顯減少（p<0.01 VSpcDNA3.1+TNFα）；而Caspase-9的活性在各組間比較無(wú)明顯差異。②細(xì)胞間接免疫熒

6、光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mipu1后，H9c2胞漿中Bid蛋白表達(dá)明顯減少。Mipu1過(guò)表達(dá)使基礎(chǔ)狀態(tài)下的Bid蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)（p<0.05 VS pcDNA3.1）；細(xì)胞經(jīng)TNFα處理之后，Bid蛋白及mRNA表達(dá)水平升高（p<0.05 VS pcDNA3.1），Mipu1過(guò)表達(dá)使TNFα誘導(dǎo)的Bid蛋白及mRNA表達(dá)水平下調(diào)（p<0.05 VS pcDNA3.1+TNFα）；并且隨著pcDNA3.1-Mip

7、u1轉(zhuǎn)入的增多，Bid蛋白表達(dá)水平逐漸下降，兩者呈量效關(guān)系。③Mipu1過(guò)表達(dá)使基礎(chǔ)狀態(tài)下的Bid基因轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)（p<0.05 VS pcDNA3.1）；細(xì)胞經(jīng)TNFα處理之后，Bid基因轉(zhuǎn)錄活性明顯升高（p<0.01 VS pcDNA3.1），Mipu1過(guò)表達(dá)使TNFα誘導(dǎo)的Bid基因轉(zhuǎn)錄活性明顯降低（p<0.01 VSpcDNA3.1+TNFα）；并且隨著pcDNA3.1-Mipu1轉(zhuǎn)入的增多，Bid基因轉(zhuǎn)錄活性逐漸下降，兩者呈量