乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達.pdf

1、雙乙酰是一種黃綠色具有特殊氣味的油狀液體。奶油、奶酪、酸奶等乳制品由于在自然發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定量的雙乙酰而具有獨特的風味。現(xiàn)廣泛應(yīng)用于配置多種香精以及一些工業(yè)用途。
　　α—αls基因編碼的α—乙酰乳酸合成酶(E.C.4.1.3.18，α—ALS)是微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生雙乙酰的關(guān)鍵酶，其作用是催化兩分子丙酮酸縮合為一分子α—乙酰乳酸。α—乙酰乳酸是一種不穩(wěn)定的分子。微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)出的雙乙酰主要是通過α—乙酰乳酸在有氧狀態(tài)下非酶

2、自然氧化而生成的。
　　本研究以乳酸乳球菌LM2345(Lactococcus lactis LM2345)的基因組DNA為模板，克隆得到α—乙酰乳酸合成酶基因——α—αls，將該基因的開放閱讀框連接到表達載體pET-30a上，獲得了pET-30a-his-α-αls和pET-30a-α-αls-his這兩個分別會在肽鏈的N端和C端表達His-tag的重組質(zhì)粒。將它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE31)。37℃下IPTG誘導后

3、，轉(zhuǎn)化了pET-30a-his-als的大腸桿菌能夠可溶化表達在蛋白質(zhì)肽鏈N段帶有His-tag的重組蛋白質(zhì)。我們通過與表達大腸桿菌的DnaK/DnaJ/GrpE分子伴侶的質(zhì)粒pKJE7共表達的方法，實現(xiàn)了在C端帶有：His-tag重組蛋白質(zhì)的可溶化表達。通過Ni親和層析的方法對重組蛋白質(zhì)進行了純化之后對酶的性質(zhì)進行了研究。發(fā)現(xiàn)N端帶有His-tag的酶不具有酶活力。該酶在穩(wěn)定劑存在的情況下，酶活力僅可以保持24小時左右。它的最適反應(yīng)溫