酸性纖維素酶基因在大腸桿菌和乳酸桿菌的表達(dá)及其活性檢測(cè).pdf

1、目前人們對(duì)纖維素酶的研究多以葡聚糖內(nèi)切酶為主，而葡萄糖外切酶是纖維素水解酶系中唯一可以作用于結(jié)晶纖維素的酶組分，其中CBHⅡ基因?qū)φ麄€(gè)纖維素酶系的表達(dá)起著重要作用。同時(shí)大量證據(jù)顯示低pH值通過(guò)阻止瘤胃內(nèi)纖維水解細(xì)/真菌生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制瘤胃纖維消化(細(xì)/真菌生長(zhǎng)要求的最低pH值為5.9)，難以建立起穩(wěn)定的工程菌。通過(guò)遺傳工程對(duì)耐受低pH值的瘤胃細(xì)菌引入纖維水解功能，可能是增強(qiáng)酸性條件下纖維水解能力的有效途徑。纖維素酶的分子生物學(xué)與基因工程研

2、究發(fā)展將會(huì)加快纖維素酶廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的進(jìn)程，為人類解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等難題都具有現(xiàn)實(shí)意義。 本試驗(yàn)就通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將得到的CBHⅡ基因工程菌，在大腸桿菌和乳酸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并對(duì)其活性進(jìn)行了檢測(cè)。 首先，以限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和SphⅠ雙酶切含有酸性纖維素酶基因的已知重組質(zhì)粒pMD18-T-CBHⅡ和非抗生素抗性穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pW425t，膠回收CBHⅡ基因片段和載體pW425t目的大片段并用T4 D

3、NA連接酶連接目的片段，即是將純化的CBHⅡ基因亞克隆至穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pW425t中，對(duì)所獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證CBHⅡ基因的核苷酸序列與GeneBank中發(fā)表的核苷酸序列的同源性達(dá)到99.79％并且其連接無(wú)誤，這樣就構(gòu)建出可以在乳酸菌與大腸桿菌之間穿梭表達(dá)的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pW425t-CBHⅡ。其次，將重組質(zhì)粒pW425t-CBHⅡ分別用CaCl2方法和電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至thyA基因缺陷型的大腸桿菌及乳酸桿菌

4、受體菌感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行培養(yǎng)和挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。第三，將轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上擴(kuò)增培養(yǎng)后，通過(guò)質(zhì)粒提取、酶切、PCR鑒定以及生長(zhǎng)功能彌補(bǔ)篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明CBHⅡ基因已經(jīng)整合入大腸桿菌中和乳酸桿菌中PCR產(chǎn)物的分子量約為1.4kb。最后，將確定已經(jīng)存在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性菌株經(jīng)SDS-PAGE分析，在大腸桿菌和乳酸桿菌種進(jìn)行表達(dá)均可見(jiàn)約49.6kd的目的蛋白。經(jīng)剛果紅染色顯示，大腸桿菌轉(zhuǎn)基因工程菌和乳酸桿菌轉(zhuǎn)基因工程菌兩種