12081.人去乙?；竤irt1的基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)

1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterCloningandExpressionofHumanSIRT1ByWenleiLVSupervisor：ProfHongminLiuMicrobialandBiochemicalPharmacySch001ofPharmaceuticalSciencesMay2014摘要摘要Sirtuin家族在生命體中廣泛存在，是依賴煙酰

2、胺腺嘌呤二核苷酸NAD的III類組蛋白去乙酰化酶，迄今為止在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的sirtuin家族成員有SIRTl。SRT7，其中對(duì)SⅡ汀1的研究最為廣泛。在SⅡ汀1介導(dǎo)的去乙酰化反應(yīng)中，NAD以共同底物的角色參與反應(yīng)，該反應(yīng)過程主要是在SIRTl的催化作用下將作用底物中的乙酰基轉(zhuǎn)移到NAD的ADP核糖基上，最終產(chǎn)物包括去乙酰化后的SIRTl底物，以及煙酰胺(NAM)和O乙?；鵄DP核糖。SIRTl的作用底物不僅有組蛋白底物，還有一部分非組

3、蛋白底物，通過對(duì)這些底物的去乙?；饔?，SIRTl參與調(diào)控了機(jī)體的眾多生理過程，例如細(xì)胞的凋亡、分化以及衰老，基因的表達(dá)調(diào)控、能量代謝等。同時(shí)S取T1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的聯(lián)系，但是其主要的作用仍存在著爭議，這主要是因?yàn)樵诎┌Y中SIRTl究竟扮演著促癌因子還是抑癌因子的角色尚不能成定論，且在不同的腫瘤組織中其表達(dá)水平不夠統(tǒng)一。盡管如此，SIRTl作為一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)，已經(jīng)得到了越來越多的科學(xué)家的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室擬采用基因工程的方法制

4、備具有高生物活性和特異性的SIRTl重組蛋白，并對(duì)體外篩選SIRTl激動(dòng)劑與抑制劑奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研對(duì)人SIRTl蛋白選取其193747位氨基酸片段作為活性片段，因所得cDNA的不正確性，采用OverlapPCR的方法對(duì)其進(jìn)行了定點(diǎn)突變，獲得了序列完全正確的活性片段，并將該片段克隆于pGEMTEasy克隆載體中。鑒定正確之后，將正確的活性片段的基因片段連接入表達(dá)載體pET28b中，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET28b／SIRTl。將

5、得到的重組表達(dá)載體pET28b／SIRTl轉(zhuǎn)化至EeoliBL21(DE3)，加入IPTG后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。提取蛋白后，經(jīng)鎳柱親和層析純化后得到目的蛋白。成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28b／SIRTl，并用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化FcoliBL21(DE3)。重組蛋白以可溶蛋白形式表達(dá)，確定誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：重組表達(dá)宿主菌37℃振搖培養(yǎng)至OD600約為08時(shí)加入終濃度為O5mM的IPTG，20℃培養(yǎng)過夜。純化后可以得到電泳純度大于90％的重組蛋白。