DNA甲基化相關的IncRNAs在原發(fā)性肝癌發(fā)生過程中的功能及機制研究.pdf

1、本研究探討受DNA甲基化調控的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在原發(fā)性肝癌發(fā)生中的潛在功能及作用機制。
　　 對于原發(fā)性肝癌發(fā)生的復雜機制已有大量的研究報道。長期以來，人們普遍認為遺傳學上的基因突變是肝癌發(fā)病機制中的關鍵，尤其是原癌基因的激活及抑癌基因的體細胞突變與肝癌的發(fā)生有著密切關系。但是，近年來隨著對肝癌研究的深入，人們發(fā)現表觀遺傳學異常在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮著非常重要的作用

2、。由遺傳學和表觀遺傳學改變所引起的原癌基因的激活及抑癌基因的失活共同導致了細胞的惡性病變，而表觀遺傳學改變甚至早于遺傳學改變，在肝癌前期即開始出現。在已知的表觀遺傳修飾類型中，DNA甲基化和長鏈非編碼RNAs是兩種重要的表觀遺傳修飾類型，其中DNA甲基化是了解較多的表觀遺傳學修飾之一。在肝癌早期所發(fā)生的原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化被普遍認為是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。而lncRNAs是一類轉錄本長度超過200nt的RNA分

3、子，可以通過各種不同的機制調控基因的轉錄及表達，并參與基因組印記及染色質修飾、轉錄激活、轉錄后調控、蛋白功能調節(jié)等多種重要的信號轉導過程。但是，目前已知確切功能的lncRNAs數量極少，對肝癌發(fā)生相關lncRNAs的了解則更加有限。根據現有對表觀遺傳修飾及其調控機制的推測，不同的表觀遺傳學修飾間是相互關聯、相互影響的，多重組分共同構成了完整的表觀遺傳學調控網絡。那么DNA甲基化的異常改變是否是lncRNAs表達受控的上游環(huán)節(jié)，并能夠通過

4、影響lncRNAs的表達來參與肝癌的發(fā)生呢？
　　 本研究中我們嘗試找到受DNA甲基化修飾調控并與肝癌發(fā)生密切相關的lncRNAs，并研究其功能與作用機制。我們首先對經去甲基化處理的肝相關細胞樣品所獲得的lncRNAs表達譜芯片數據進行分析，以表達量差異兩倍以上、啟動子區(qū)含CpG島、人鼠同源性高等原則初步篩選出一系列的lncRNAs，然后在多種肝細胞系、肝癌細胞系及腫瘤樣本癌與癌旁組織中對這些候選lncRNAs進行了RNA水平表

5、達量的檢測，繼而對其進行了相應位點的DNA甲基化水平檢測，選取表達量改變符合芯片數據，且DNA甲基化改變差異明顯的lncRNAs作為候選分子。其中，經DAC(5-雜氮胞苷)去甲基化處理后，啟動子區(qū)DNA甲基化水平變化顯著的lncRNA-AY927547在肝癌細胞系及肝癌組織中的RNA表達量發(fā)生明顯下調。為了進一步分析該lncRNA與腫瘤表型的潛在關聯，我們對lncRNA-AY927547分別進行了RNA干擾及過表達，在體外細胞水平對其在

6、增殖、遷移及凋亡上發(fā)揮的功能進行了進一步驗證，結果顯示lncRNA-AY927547能夠抑制腫瘤細胞的增殖與遷移。我們繼而對lncRNA-AY927547的作用機制進行了研究，利用RNA-pulldown技術發(fā)現lncRNA-AY927547能與M2型丙酮酸激酶(M2 isoform of pyruvate kinase， PKM2)發(fā)生結合，進一步的RNA免疫沉淀實驗證實了其結合的特異性。在此基礎上，研究發(fā)現lncRNA-AY9275