DNA甲基化相關(guān)的IncRNAs在原發(fā)性肝癌發(fā)生過程中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、本研究探討受DNA甲基化調(diào)控的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在原發(fā)性肝癌發(fā)生中的潛在功能及作用機(jī)制。
　　 對于原發(fā)性肝癌發(fā)生的復(fù)雜機(jī)制已有大量的研究報(bào)道。長期以來，人們普遍認(rèn)為遺傳學(xué)上的基因突變是肝癌發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵，尤其是原癌基因的激活及抑癌基因的體細(xì)胞突變與肝癌的發(fā)生有著密切關(guān)系。但是，近年來隨著對肝癌研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)異常在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮著非常重要的作用

2、。由遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)改變所引起的原癌基因的激活及抑癌基因的失活共同導(dǎo)致了細(xì)胞的惡性病變，而表觀遺傳學(xué)改變甚至早于遺傳學(xué)改變，在肝癌前期即開始出現(xiàn)。在已知的表觀遺傳修飾類型中，DNA甲基化和長鏈非編碼RNAs是兩種重要的表觀遺傳修飾類型，其中DNA甲基化是了解較多的表觀遺傳學(xué)修飾之一。在肝癌早期所發(fā)生的原癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化被普遍認(rèn)為是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。而lncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA分

3、子，可以通過各種不同的機(jī)制調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并參與基因組印記及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白功能調(diào)節(jié)等多種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。但是，目前已知確切功能的lncRNAs數(shù)量極少，對肝癌發(fā)生相關(guān)lncRNAs的了解則更加有限。根據(jù)現(xiàn)有對表觀遺傳修飾及其調(diào)控機(jī)制的推測，不同的表觀遺傳學(xué)修飾間是相互關(guān)聯(lián)、相互影響的，多重組分共同構(gòu)成了完整的表觀遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。那么DNA甲基化的異常改變是否是lncRNAs表達(dá)受控的上游環(huán)節(jié)，并能夠通過

4、影響lncRNAs的表達(dá)來參與肝癌的發(fā)生呢？
　　 本研究中我們嘗試找到受DNA甲基化修飾調(diào)控并與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的lncRNAs，并研究其功能與作用機(jī)制。我們首先對經(jīng)去甲基化處理的肝相關(guān)細(xì)胞樣品所獲得的lncRNAs表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以表達(dá)量差異兩倍以上、啟動(dòng)子區(qū)含CpG島、人鼠同源性高等原則初步篩選出一系列的lncRNAs，然后在多種肝細(xì)胞系、肝癌細(xì)胞系及腫瘤樣本癌與癌旁組織中對這些候選lncRNAs進(jìn)行了RNA水平表

5、達(dá)量的檢測，繼而對其進(jìn)行了相應(yīng)位點(diǎn)的DNA甲基化水平檢測，選取表達(dá)量改變符合芯片數(shù)據(jù)，且DNA甲基化改變差異明顯的lncRNAs作為候選分子。其中，經(jīng)DAC(5-雜氮胞苷)去甲基化處理后，啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平變化顯著的lncRNA-AY927547在肝癌細(xì)胞系及肝癌組織中的RNA表達(dá)量發(fā)生明顯下調(diào)。為了進(jìn)一步分析該lncRNA與腫瘤表型的潛在關(guān)聯(lián)，我們對lncRNA-AY927547分別進(jìn)行了RNA干擾及過表達(dá)，在體外細(xì)胞水平對其在

6、增殖、遷移及凋亡上發(fā)揮的功能進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示lncRNA-AY927547能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。我們繼而對lncRNA-AY927547的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，利用RNA-pulldown技術(shù)發(fā)現(xiàn)lncRNA-AY927547能與M2型丙酮酸激酶(M2 isoform of pyruvate kinase， PKM2)發(fā)生結(jié)合，進(jìn)一步的RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其結(jié)合的特異性。在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-AY9275