蘋果愈傷組織形成過程中DNA甲基化的研究.pdf

1、ResearchofDNAmethylati0IIduringtIIe10rmation0IcawintlUcetllromJ1pnl6apple(Malusdomestica)leavesThesissubmittedtoqingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceLvXiaoting(Department

2、ofLifeScience)Supervisor：WangAihuaQingdaoChinaJune，2012青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要蘋果愈傷組織形成過程中DNA甲基化的研究摘要本研究選用‘嘎啦’蘋果葉片及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織為材料，利用MSAP標(biāo)記分析愈傷組織形成過程中DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，研究DNA甲基化在愈傷組織形成過程申的作用，從分子水平解析愈傷組織形成的機(jī)制。主要結(jié)果如下：1適宜培養(yǎng)基的篩選以‘嘎啦’蘋果組培苗為

3、材料，實(shí)驗(yàn)獲得適合‘嘎啦’蘋果組培苗繼代增殖的培養(yǎng)基：MSBA2omg／LNAA01mg／L，適合‘嘎啦’蘋果組培苗壯苗的培養(yǎng)基：MSBA08mg／L，在該體系下建立單芽系組培苗，以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)遺傳背景一致。并用該單芽系葉片在MsNAA05mg／LBA20mg／L2，4一D20mg／L培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織。25一azaC對(duì)愈傷組織形成的影響在篩選獲得的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別添加濃度0、001、01、1、10、100、500umol／

4、L的5azaC。以葉片為外植體，接種后置于溫度26℃的培養(yǎng)室暗培養(yǎng)。結(jié)果表明：低濃度的5azaC(001、01、1、10umol／L)處理對(duì)愈傷組織的形成沒有顯著影響，100“mol／L5azaC處理的愈傷組織形成時(shí)間比對(duì)照組提前3d，而高濃度500“mol／L處理中，外植體在愈傷組織誘導(dǎo)的23d左右開始出現(xiàn)泛黃現(xiàn)象，最終干枯死亡。3蘋果MSAP實(shí)驗(yàn)體系的優(yōu)化與建立以源于同一單芽系蘋果組培苗的葉片誘導(dǎo)獲得的的愈傷組織為材料，提取基因組D

5、NA，優(yōu)化并建立了MSAP實(shí)驗(yàn)體系。其中雙酶切體系中舍DNAlug；EcoRI，HapII或MspI各10U；37℃孵育12h。20“L預(yù)擴(kuò)增體系：酶連產(chǎn)物1uL、上下游引物各3HL、2PCRm8stermix10uL(Taq酶1U、dNTPs5mM、M9230mM)、ddH203“L。20uL選擇性擴(kuò)增體系，含60倍稀釋的模板DNA2uL、上下游引物各3uL、2xPCRm8stermix10“L(Taq酶1U、dNTPs5mM、Mg”